通过扩增青霉素生物合成基因簇提高产黄青霉在固态跟液态发酵中的资料.pptVIP

通过扩增青霉素生物合成基因簇提高产黄青霉在固态和液态发酵中的青霉素产量World J Microbiol Biotechnol (2008) 第二组 材料和方法 产黄青霉Wis54-1255——青霉素低产菌株 产黄青霉Wis54-1255 npe10——其青霉素基因簇不完整 产黄青霉P2-32——青霉素高产菌株 可容纳青霉素基因簇以串联重复的方式扩增数倍 产黄青霉NRRL 1951（野生型）——用作基因文库的DNA源 枯草芽孢杆菌ATCC 6633——用于在生物测定中评估青霉素G的产量 大肠杆菌DH5a——用于粘性质粒基因文库和一般基因操作的受体 基因组文库的构建 基因组文库的筛选 真菌的转化 青霉素在琼脂上的产量 液态发酵 固态发酵 数据分析 对于固态和液态发酵实验，实验结果为两个独立实验的平均值，样品（整个培养瓶或圆柱发酵罐）为一式三份。 对原始和转化菌株的青霉素产量采用Student’s T-test方法进行分析。 结果与讨论 在粘性质粒载体IztapaCos中构建了一个基因组文库，该文库携带有一个腐草霉素抗性基因，且可直接转入真菌之中，不需进一步的亚克隆。 首要目标——分离出一个含有整套青霉素基因簇的粘性质粒克隆。 利用整套基因簇来增加青霉素基因的拷贝数而不是转入单个的pcbAB和pcbC-penDE基因。 为实现这一目标，用分别位于基因簇的两个末端的探针pcbAB和penDE对基因组文库进行了筛选。对E.coli进行的13次克隆证实这两个探针都已分离出来并获得了粘性质粒DNA。 结果与讨论 以此方式形成的重组粘性质粒继续呈递进行Southern分析，分析中仍然使用相同的两个探针以确定它们包含整套的青霉素基因簇。其中一个名为IztapaCos-pen5的粘性质粒（图2 第5列），被用于转化产黄青霉。 结果与讨论 转化菌株Wis54-1255和P2-32被转移至腐草霉素浓度不断增高的琼脂培养基上，以便选出含有高拷贝数的选择标记基因ble的菌株，也就是含有高拷贝数青霉素基因簇的菌株。转化菌株中的6株Wis54-1255和3株P2-32可以在含有60μg/ml腐草霉素添加剂的培养基上生长。 同时利用在琼脂鞘上的发酵来检测所有转化菌株的青霉素产量。检测中青霉素产量最高的菌株是对60μg/ml腐草霉素有抗性的转化菌株。我们将此两种菌株中筛选出的青霉素产量最高的转化菌株分别命名为TW和TP。 对液态发酵和固态发酵中TW和TP菌株的青霉素产量作了仔细检测，并在同一实验中与其亲本菌株的发酵产量作了比较。在亲本菌株内转入IztapaCos（空载体）作为对照，该转化菌株的青霉素产量略微低于原菌株的青霉素产量。 结果与讨论 相对于亲本菌株，转化菌株TW和TP的青霉素产量在两种培养体系中均有显著提高。然而，来源于菌株P2-32的转化菌株TP的青霉素产量则提高的更多。 结果与讨论 关于产黄青霉( P. chrysogenum )青霉素产量的早期研究表明微生物在固态发酵中的生理生化反应与在液态发酵中的大不相同，从而导致了它们在两种培养系统中产量水平的差异。这一信息指出了设计能够特别适合于固态发酵菌株的改进方法的必要性（Barrios-Gonza′lez et al. 1993a; Barrios-Gonza′lez and Mej?′a 2007）。研究表明越接近于野生型的菌株在固态发酵能越高效地发挥其青霉素生产潜力，这说明在遗传改良过程中，为适合液态发酵而开发的工业高产菌株，正在失去一些（未知）有助于其在固体培养基上很好地适应和生长的重要功能，（Barrios-Gonza′lez et al.1993a）。寻找这些引起所谓的固体培养生理性的“固体培养基因”已成为当前研究的主题（Barrios-Gonza′lez et al. 2008; Ishida et al. 2000; Te Biesebeke et al. 2005）。 结果与讨论 这与实验结果相符，菌株Wis 54-1255比P2-32更接近于野生型，其由于额外拷贝的转入而导致的在固态发酵中产量的增加比P2-32更高。相反地，对于菌株P2-32，额外拷贝的转入则在液态发酵中起到更加显著的作用。显然，在Wis中更加保守的“固态培养基因”促进了其新的生物合成能力在固态发酵中的发挥，而这些基因在菌株P2中没有很好地保留（或激活）。另一项试验结果也可用相同的原理来解释，那就是Wis在固态发酵和液态发酵（培养系统）间产量水平的差别在TW转化株上更加显著，而这种差别在P2转化株上则较小。 结果与讨论 高青霉素滴度产黄青霉工程菌内含有高拷贝的青霉素基因簇，且此高拷贝以串联重复方式排列（Fierro et al. 1995; Newbert 1997）。到目前为止，通过转入额外青霉素基因拷贝