细胞培养的个人体会2013.9.10.pptxVIP

肖 飞 (Jinan university，5350877@) 内部交流，仅供参考 细胞培养的个人体会 如何做好实验？ “播下一种习惯，你将收获一种性格； 播下一种性格，你将收获一种命运”。 威廉.詹姆士 个人体会： 题外话： 1、 “养成良好的实验习惯”。 实验前：查资料，计划好，充分准备。 实验中：认真操作，关键点作好记录。 （可写在草稿本上）。 实验后：整理实验物品，用过的东西要放回原位， 及时清理垃圾， 抽空根据草稿本详细写下实验记录。 （写在实验记录本上） 实验其间，听从老师和师兄、师姐的安排和管理！ 2、“养成独立思考、独立解决问题的习惯” 全面提高自己的能力，力求能独挡一面。遇到问题，首先自己想办法去解决。 3、“养成良好的心态” “雄心” : 有抱负和理想，做好文章。 “恒心” ：坚持。 “平常心” ：从容淡定，慢而不拖，快而不乱. 4、 “苦干 + 巧干” 苦干：多练习，熟能生巧。“做” 巧干：多总结，掌握规律。“思” 内容提要 1.细胞培养简介 2.细胞的复苏和冻存 细胞的复苏 细胞的冻存 3.细胞的换液与传代 个人方法 无菌操作技术 细胞计数和接种 体外培养（in vitro culture）：是将活体成分或其寄生体内取出，放在类似于体内生存环境的体外 环境中，让其生长和发育的方法。 可分为器官培养、组织培养、细胞培养三种类型。 细胞培养分为原代培养和传代培养。 体外培养 简化环境因素、排除了体内实验时一些复杂的因素的影响，利于应用各种物理、化学和生物等外界因素探索和提示细胞生命活动的规律； 提供了大量生物性状相同的细胞，特别是人的活细胞材料作为研究对象。经济、便利，解决了不能用人做实验的问题。 缺点是无法模拟体内的情况，结果有局限性。 细胞培养的特点 CO2培养箱 细胞培养基本设备 定期清洁，换水。 拿出细胞及时关好门，保持CO2浓度。 短时不用，将光源调至最小，避免 反复开关。 长时不用，及时关电源。 使用注意问题： 倒置显微镜 超净工作台 使用前紫外照20-30分钟。 使用时别忘关紫外，防止灼伤。 定期换水，保持干净的水。 使用前检查水位，不足补充纯水。 最好细胞培养专用一个灭菌锅。 使用注意问题： 高压灭菌锅 培养瓶、培养管、细胞培养板、蓝盖瓶、吸管； 离心管、细胞冻存管、1ml 、5ml EP管； 血细胞计数器； 恒温磁力搅拌器、恒温水浴振荡器； 刀、剪、镊解剖用具，200目不锈钢网； 细胞培养的基本用品 大多数培养基是建立在平衡盐溶液(BSS)基础上， 添加了氨基酸、 维生素和与血清中浓度相似的营养物质。 选择培养基很重要，不同细胞需要适合的培养基。 常见的培养基有：DMEM、F12、DMEM/F12、1640等。 基础培养基 一般是从牛的血液中提取，含有丰富的营养养物质。 常用的胎牛血清（Fetal Bovine Serum,FBS),使用前分装50ml离心管，-20℃保存。注意解冻分装前请混合均匀。  使用时放在4 ℃冰箱解冻，需1-2天。 血 清 血清和基础培养基按一定比例混合，一般配制含10-15%血清的培养基，用于细胞培养。 如取20ml 胎牛血清，同时加入180ml DMEM基础培养基，即可配成200ml含10%胎牛的 DMEM. 完全培养基 器皿加洗洁精浸泡数小时后，用自来水冲洗9次， 然后蒸馏水冲洗3次。 烘干：洗干净后烘干。 包装：用牛皮纸或布包装。 消毒前贴上灭菌条，条上写明日期、物品、所有者。 可重复利用物品的清洗和灭菌 高压灭菌：包装好的器皿装入高压锅内，121 ℃， 维持30分钟。 灭菌后烘干：高压消毒后器皿会被蒸气打湿，要放入烤箱内烘干备用。 注意：泡酸（重铬酸钾120g：浓硫酸200ml：蒸馏水 1000ml）浸泡12小时。 （玻璃器皿第一次洗需要用，以后可以省这一步）。 细胞的复苏和冻存 细胞复苏与冻存的原则是“慢冻速融”。 复苏细胞时，速度要快，使之迅速通过细胞最易受损的－5℃～0℃。 冻存细胞时，向培养基中加入保护剂二甲基亚砜（DMSO），可使冰点降低，在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，减少 细胞冰晶的形成。 复苏与冻存的原则 1