活化星形胶质细胞去抑制调控视神经再生的实验研究-眼科学专业论文.docxVIP

活化星形胶质细胞去抑制调控视神经再生的实验研究中山大学中山眼科中心 活化星形胶质细胞去抑制调控视神经再生的实验研究 中山大学中山眼科中心 专 业： 眼科学 博士研究生： 范志刚 导 师： 葛坚教授 摘 要 目 的 青光眼是全球第2位不可逆致盲眼病，其病理基础为视网膜节细胞轴突 损伤后发生细胞凋亡。针对视网膜节细胞轴突损害进行的神经再生治疗是青 光眼防治的根本措施。最新的研究结果提示，星形胶质细胞活化可能是抑制 哺乳动物中枢神经系统再生最重要的因素。本研究分别通过基因敲除星形胶 质特异性中间丝成分GFAP和Vimentin以减弱其活化能力或者通过GFAP．TK 和GCV系统选择性杀死活化星形胶质细胞来探索活化星形胶质细胞去抑制对 视神经再生的调控作用。 方 法 1． 转基因和基因敲除实验动物 Bcl一2高表达转基因小鼠(Bcl-2 tg)、GFAP-TK转基因小鼠(GFAP-TK tg)、 GFAP／Vimentin双基因敲除小鼠(GFAP√n，im斗)、Bel．2转基因+GFAP小厂vim小双 基因敲除三基因突变小鼠(Bcl．2tg／GFAP√嘲m斗)、Bcl．2和GFAP．TK双转基因 小鼠(Bcl一2 tg／GFAP—TK tg)。对照组实验动物采用上述各种实验小鼠同窝的相 应非转基因小鼠。 2．大脑皮质星形胶质细胞分离、原代培养以及诱导激活分别从出生当天(P0)或出生后一天(P1)野生型C57BL／6J小鼠和 2．大脑皮质星形胶质细胞分离、原代培养以及诱导激活 分别从出生当天(P0)或出生后一天(P1)野生型C57BL／6J小鼠和 GFAP／Vimentin双基因敲除小鼠大脑皮质分离培养星形胶质细胞。星形胶质细胞 原代培养4周后，使用曼陀罗凝集素(DSA)刺激未成熟星形胶质细胞进行分化 和激活。观察并比较两组星形胶质细胞的形态以及DSA激活后的反应。 3．视网膜一上丘组织器官共培养 分别选取出生后3天(P3)Bcl．2高表达转基因小鼠和野生型C57BL／6J小 鼠的视网膜并分别与出生后5天(P5)的C57BL／6J和GFAP斗Mm以小鼠上丘 (superior colliculus)组织切片并置共培养5天，应用红色DiI细小结晶颗粒显 示从视网膜长入上丘的轴突纤维。 4．视神经完全性钳断手术 分别在P5和P20 Bcl．2 tg／GFAP小厂vim士小鼠及其同窝GFAP√n，im士对照小鼠 进行标准的右眼视神经完全性钳断手术；在成年Bcl．2 tg／GFAP．TK tg双转基因 小鼠及其同窝的GFAP．TK tg，Bcl．2 tg和野生型小鼠中行视神经完全性钳断手 术。在部分实验动物中，术中同时在玻璃体腔内注射霍乱毒素B亚单位结合的 荧光素标记物CTB--FITC或CTB--Rhodamine，或者增强表达绿色荧光蛋白的 复制缺陷型腺相关病毒(AAV．EGFP)用于顺行性标记再生轴突是否达到上位视 觉中枢外侧膝状体及上丘。所有手术在单侧右眼完成。 5．视神经损伤后GFAP表达的Western Blot和RT-PCR检测 分别选取8．12周龄成年野生型C57BL／6J小鼠未进行视神经钳断手术的视神 经4根及行视神经钳断手术后三天的视神经4根分别提取细胞总蛋白质和总 RNA进行GFAP的Western Blot和RT-PCR检测。 6．组织切片制作及免疫荧光染色 4％多聚甲醛心脏灌注后获取完整眼球、视神经和大脑标本，OCT包埋制作 冰冻切片。眼球及视神经标本以平行视神经轴向作冷冻切片，厚度101．un。脑组 织作冠状连续切片，厚度20岬。在相邻的眼球及视神经切片上分别加兔抗 GAP．43多克隆抗体(1：400)和鼠抗GFAP单克隆抗体(1：200)，抗体溶于3％ 胎牛血清白蛋白+0．3％Tritonl00中。二抗使用Cy3或Cy5标记的抗兔或抗鼠单 II 克隆抗体。Nikon 克隆抗体。Nikon TE300荧光显微镜和Leica共焦显微镜下观察，计数定量以及 照相。 7．电生理检查和视觉功能检查 对部分P20 Bcl．2 tg／GFAP√-／Ⅵm4小鼠在视神经手术后1 0天，获取包括背外 侧膝状体核的旁矢状大脑组织切片，并进行全细胞膜片钳检查以确定视神经再生 轴突是否达到背外侧膝状体核，并与其神经元建立了突触联系。视神经手术前、 手术后1天及手术后10天分别进行瞳孔对光反射检查。 结 果 1．大脑皮质星形胶质细胞分离培养及DSA激活 实验发现培养的野生型C57BL／6J星形胶质细胞经DSA激活后，细胞肥大 增生，突起明显延长并超过细胞体尺寸，同时GFAP免疫荧光染色呈较强阳性。 GFAP√／Vim4双基因敲除小鼠的星形胶质细胞彪态钝圆，细胞突起短小，对DSA 反应不明显。 2．视网膜一上丘组织器官共培养 P