磺胺类药物残留ELISA快速检测试剂盒的研制-预防兽医学专业论文.docxVIP

华中农业大学2006硕士毕业论文摘要 华中农业大学2006硕士毕业论文 摘要 本研究通过单克隆抗体的纯化，直接竞争ELISA方法的确立，样品提取方法的 优化，直接竞争ELISA标准曲线的建立，动物试验以及与国外同类试剂盒和仪器方 法的比较，建立了检测食源性动物产品中磺胺嘧啶和磺胺类药物残留的两种ELISA 检测方法，并在此基础上相应地研制出两个快速检测试剂盒。研究结果如下： 1、利用本实验室已有的抗磺胺嘧啶单克隆抗体细胞株(SD-4)经复苏、筛选、 生产、纯化得到抗磺胺嘧啶单克隆抗体。用重氮化一偶联法将磺胺嘧啶(SD)与卵 清白蛋白(0vA)按投料摩尔比2：1连接制备了包被抗原(SD．OVA)，用过碘酸 钠法将SD．OVA与辣根过氧化物酶(HRP)按投料摩尔比1：2连接制备了酶标抗原 (SD．OVA-HRP)。药物竞争试验确定了直接竞争ELISA方法；将常规包被与微波包 被法从方法的灵敏度、包被时间、包被稳定性进行比较，确立微波包被法。直接竞 争ELISA试验在lng／ml_r-729 ng／mL浓度范围建立标准曲线方程y=12．05x+2．2538， 线性相关系数R2=0．995， IC50为41．7ng／mL。与磺胺间甲氧嘧啶(SMM)、磺胺 对甲氧嘧啶(sMD)、磺胺二甲氧嘧啶(SDM)、磺胺二甲嘧啶(SMD、磺胺喹嗯 啉(SQ)及磺胺甲唔唑(SMZ)的交叉反应率分别为：1．7％、3．1％、O．01％、0．01％、 0．01％、3．4％。建立了猪肉、鸡肉、鸡肝、鸡蛋、牛奶中SD提取方法，进而研制 出SD酶联免疫检测试剂盒，在猪肉、鸡肉、鸡肝中定量限为20”g／kg，回收率70 ％一110％，批间变异系数26％；在鸡蛋、牛奶定量限为5／zg／kg，回收率60％．120 ％，批问变异系数32％。与同类试剂盒比较，结果表明自制试剂盒与英国试剂盒准 确度、精密度水平相当，灵敏度低于英国试剂盒。饲喂仔肉鸡含500mg／kg SD饲料 7d，停药后连续检测5d，自制试剂盒测定鸡肉中SD残留量与高效液相色谱法 (I-IPLC)测定结果相近。同时，饲喂蛋鸡含400 mg／kg SD饲料5d，停药7d连续检 测，自制试剂盒与国外试剂盒测定结果相符合。 以上结果表明，本研究研制的试剂盒能够满足猪肉、鸡肉、鸡肝、鸡蛋、牛奶 中SD残留检测要求，试剂盒研制工作基本完成。 2、利用本实验室已有的抗磺胺类药物单克隆抗体的细胞株(SDL-4)采取与SD--4 株细胞相同步骤得到抗磺胺类药物单克隆抗体。采用混合酸酐法将本实验室合成的 磺胺类药物母核结构药物(SDL)与人血清白蛋白(HSA)按投料摩尔}=L2：l连接制备 了包被抗原SDL-HSA，用过碘酸钠法将SDL-HSA与辣根过氧化物酶(HRP)按1：2连 接制备了酶标抗原(SDL-HSAoHRP)直接竞争ELISA方法10ng／mL～2430ng／mL范围 建立标准曲线方程y=14．571x+2．2619，RZ=0．987，ICso为153．0 ng／mL，与SMM、 SMD、SQ、SDM、SD、SM2、SMZ、磺胺甲氧嗪(SMP)和三甲氧苄氨嘧啶(TMP) 的交叉反应率分别为：166．8％、100％、105％、38．7％、11．9％、4．9％、O．01％、12．O％、 O．01％。建立猪肉、鸡肉组织中SAs提取方法，进而研制出SAs酶联免疫检测试剂 磺胺类药物残留ELISA快速检测试制盘的研制盒，定量限2叻g，kg，回收率70％一1lO％，批间变异系数(26％。s缸酶联免疫检测试 磺胺类药物残留ELISA快速检测试制盘的研制 盒，定量限2叻g，kg，回收率70％一1lO％，批间变异系数(26％。s缸酶联免疫检测试 剂盒性能还未完善和试剂盒商品化有待进一步研究。 关键词磺胺类药物：磺胺嘧啶；单克隆抗体；酶标抗原：酶联免疫吸附试验；试剂 盒；残留；食源性动物产品 Ⅱ 华中农业大学2006硕士毕业论文Abstract 华中农业大学2006硕士毕业论文 Abstract The research established two competitive direct EL【SA(CdELISA)methods to detect sulfadiazine(sD)and sulfonamides(SAS)residues in edible animal products．And on the base of the two methods two ELISA Kits were developed respectively．The results are as follow： 1．After resuscitation，screemng，ascites production and purificat