中华蜜蜂化学感受蛋白CSP1的功能模式分析及亚细胞-中国农业科学.PDF

中国农业科学 2017,50(15):3052-3062 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2017.15.019 中华蜜蜂化学感受蛋白CSP1的功能模式分析及亚细胞定位 1 1 1 1 1 2 1 谭静 ，宋欣密 ，傅晓斌 ，唐明珠 ，吴帆 ，华启云 ，李红亮 1 2 （中国计量大学生命科学学院/生物计量及检验检疫技术浙江省重点实验室，杭州 310018 ； 金华市农业科学院，浙江金华 321000 ） 摘要：【目的】研究中华蜜蜂（ Apis cerana cerana，简称中蜂）重组化学感受蛋白CSP1与不同化学信息素 的结合功能、模式及其亚细胞定位，明确触角特异表达的 CSP1 蛋白功能。【方法】将克隆的中蜂CSP1 构建至 pET-32a(+)载体并转入 BL21(DE3)感受态细菌中，挑取单克隆菌落接种于 LB 培养基，培养过夜后按 1%（V/V）进 行转接，继续培养至 OD -1 600 ≈0.4 左右时，加入 IPTG 至终浓度为 1 mmol·L 后继续诱导 5 h。将诱导好的 CSP1 大肠 杆菌菌液离心弃上清，再加入细菌裂解液超声破碎，离心后上清用镍柱对CSP1重组蛋白进行亲和层析纯化，再经 PBS透析液透析后，最终获得可溶的具有生物活性的CSP1 重组蛋白。设定荧光分光光度计的激发波长为281 nm， 测定竞争性荧光探针 1-NPN 与 CSP1 的相互作用，用 Scatchard 方程计算其解离常数，再计算获得 CSP1 与各种候 选化学信息素的亲和力。以 CSPMbraA6 晶体结构（PDB 代码：1n8v）为模板，通过同源建模和分子对接解析 CSP1 蛋白与化学信息素的结合模式，根据 MolDock Score 选出最佳对接模型进行作用机理分析，获得结合时配基周围 的CSP1残基分布以及氢键产生情况，以此获得信息素与CSP1的结合模式。最后将CSP1免疫注射兔子获得多克隆 抗体，并对中蜂工蜂触角进行低温固定、脱水和包埋后进行超薄切片，然后对样品切片进行免疫胶体金电镜定位， 以解析CSP1在触角感器中的亚细胞分布。【结果】成功诱导获得可溶性的重组中蜂CSP1蛋白，利用荧光光谱分析 1-NPN 与 CSP1 的解离常数 -1 K1-NPN 为 2.1 μmol·L ，结合位点数 n 为 0.99，表明结合时基本以 1 ﹕1 结合，线性相关 系数为0.9933。在9种化学信息物质中，CSP1与两种蜜蜂蜂王信息素成分对羟基苯甲酸甲酯(HOB)和9-羰基-2 癸 烯酸（9-ODA），和植物挥发物成分 3-蒈烯均具有较强的结合能力，其中与 CSP1 亲和力最强的对羟基苯甲酸甲酯 的[ -1 IC ]和解离常数 K 分别达到 10.1 和 7.68 μmol·L 。分子对接显示不同配基与 CSP1 的结合分别是通过与 CSP1 50 D 疏水腔中特定氨基酸残基（或借助于氢键）作用结合。典型的如CSP1与 HOB相互作用过程中，预测主要由8个氨 基酸残基贡献能量，包括 4 个疏水性残基（Phe30、Phe44、Leu70 和 Phe85），3 个极性中性残基（Tyr26、Tyr27 和 Ser41）以及 1 个酸性残基（Asp40），其中 Asp40 中两个羧基上的氧原子分别与 HOB 苯环中羟基上的氧原子分 别产生一个氢键。免疫电镜定位结果显示CSP1主要表达于板形