基于PCR的质粒快速定点诱变方法建立与评价-中国生物化学与分子.PDF

ＩＳＳＮ　 １００７⁃７６２６ 中国生物化学与分子生物学报　 ｈｔｔｐ：／ ／ ｃｊｂｍｂ．ｂｊｍｕ．ｅｄｕ．ｃｎ ２０１８年１月 ＣＮ　 １１⁃３８７０／ Ｑ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３４（１）：６１～６８ ＤＯＩ：１０１３８６５／ ｊ．ｃｎｋｉ．ｃｊｂｍｂ 基于ＰＣＲ 的质粒快速定点诱变方法建立与评价 １），３） ２） ３） １）∗ 陈　 凡 ，　 傅一勤 ，　 林梅西 ，　 汪少芸 １） ２） ３） （ 福州大学，福州　 ３５０１１６； 福建省安溪县医院，福建 安溪　 ３６２４００； 福建省闽中有机食品有限公司，福建莆田　 ３５１１００） 摘要　 基因突变对生命的进化具有重要意义，针对质粒的ＤＮＡ 定点诱变技术也是基因工程、蛋白 质工程研究中的重要手段之一。 为了提高质粒定点诱变的效率，本研究利用引物部分重叠的设计 方案，使用Ｔ 值相对固定的引物设计模式，将同一引物分为重叠区（Ｔ ＝５０±２℃）和非重叠区（Ｔ ｍ ｍ ｍ ＝６０±２℃），并在严格控制模板用量（２ ｐｇ／ ｋｂ）的基础上，通过２０ 个ＰＣＲ循环对目标质粒进行定 点诱变扩增，随后取０５ μＬ产物直接用于转化。 在ＦａｓｔＰｆｕ Ｆｌｙ 酶系中，利用此法构建了６ 个含碱 基替换、缺失和插入的质粒，均获得成功，突变效率可达９６％以上，阳性克隆获得数达７０ 个以上。 此外，利用４种不同ＰＣＲ酶系对该法的适用性进行了评价，结果表明突变效率均可达９３％以上，阳 性克隆获得数均在１０ 个以上。 通过适当增加ＰＣＲ模板用量（１０ ｐｇ／ ｋｂ）并使用纯化后的ＰＣＲ产物 ６ 进行转化，该法可适用于转化效率大于１０ （ｃｆｕ／ μｇ）的任意感受态细胞，对应的突变效率可大于 ９１％，阳性克隆获得数大于２０。 根据本法的作用原理，该方案适合质粒中１０～２０ ｂｐ（因重叠区ＧＣ 含量及碱基序列的不同而改变）以内的任意碱基替换和插入，以及任意长度的ＤＮＡ 片段缺失。 且 具有通用性强、耗时少、诱变成功率高、成本低、对感受态及转化效率无特殊要求等优点，适合各实 验室的日常研究使用。 关键词　 ＰＣＲ；质粒；定点诱变；部分重叠 中图分类号　 Ｑ７８５ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｒａｐｉｄ ＰＣＲ Ｂａｓｅｄ Ｓｉｔｅ⁃ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｆｏｒ Ｐｌａｓｍｉｄｓ １），３） ２） ３） １）∗ ＣＨＥＮ Ｆａｎ ，ＦＵ Ｙｉ⁃Ｑｉｎ ，ＬＩＮ Ｍｅｉ⁃Ｘｉ ，ＷＡＮＧ Ｓｈａｏ⁃Ｙｕｎ １） ２） （ Ｆｕｚｈｏｕ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｆｕｚｈｏｕ３５０１１６，Ｃｈｉｎａ； Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ Ａｎｘｉ，Ａｎｘｉ３６２４００，Ｆｕｊｉａｎ，Ｃｈｉｎａ；