免疫组化的基本原理修改版课件.pptVIP

免疫组化的基本原理; ; 免疫组化是免疫学与组织化学相结合的一个新学科。它有三个基本要素： 免疫反应系统 示踪系统，示踪剂如辣根过氧化酶，碱性磷酸酶。 显示系统，显示剂 如3，3 二氨基联苯胺（DAB)， 3-胺基-9-乙基卡巴（AEC） 由于它是以免疫学的抗原抗体反应为理论基础，所以首先必须了解与其有关的免疫学理论。 ;免疫反应系统;抗原的概念;抗体的概念; 抗原与抗体的结合是高度特异性的结合，这种结合是非常牢固的。 　　 ;抗原抗体结合后，其复和物是不可见的。为了使得反应复合物可见，必须将抗体加以标记，并利用标记物同其他物质的反应将阳性结果转换成可见的发光或 显色。多年来，免疫组化工作者 经过不断探索，使得免疫组化的示踪系统和显色系统不断改进。;; 1941年COONS等用荧光素标记抗体，检测肺炎双球菌在肺组织内的分布，开???了免疫荧光化学的新篇章。;免疫荧光细胞化学;荧光素; 该技术的主要优点是：特异性强、敏感性高、速度快。主要缺点是：非特异性染色问题尚未完全解决，结果判定的客观性不足，技术程序也还比较复杂。荧光衰减，标本不易久存，且需价格昂贵的荧光显微镜 ; ;免疫酶细胞化学;一、直接法 原理：HRP标记在特异性抗体 （一抗）上，即形成 “ 抗原---抗体● HRP复合物”;组织抗原;步骤：一步完成 特点：方法简便、省时，专一 性强，非特异染色轻， 但敏感性差，一种标记 抗体只能检测一种抗原。;二、间接法 原理：HRP标记在第二抗体上， 抗原---特异性抗体---第 二抗体● HRP复合物 步骤：二步法;第二抗体;特点：敏感性较直接法高，一 种标记抗体能用于相应 动物制备的多种特异性 抗体，检测多种抗原。 但较直接法费时，非特 异染色稍重。 ; 酶标抗体技术也还存在一些问题，最主要的是酶与抗体连接可损害二者的活性。20 世纪70年代初，发展了非标记抗体酶法，包括酶桥法 ，PAP法。;三、酶桥法;酶桥法;特点;四、PAP法;PAP法;特点;五、APAAP法; 本世纪70年代???后随着免疫组化的广泛应用，技术方法不断改进，亲和组织化学引入免疫组化，形成抗生物素-生物素免疫组化染色系统。 ;基本原理;五、ABC法;Avidin（卵白素、亲和素、抗生物素）为一种碱性糖蛋白，由四个相同亚基组成 Biotin（生物素）小分子维生素 Avidin和Biotin具有较高亲和力; 酶素化Biotin＋Avidin --- ABC复合物 抗原---特异抗体--- Biotin标记第二抗体--- Avidin ● Biotin ● HRP 复合物：composition ;;ABC法原理示意图 ;步骤：三步法 特点：敏感性较高，特异性强， 应用范围广 ; ● 某些脏器存在内源性生物素 干扰 ● Avidin与核酸及细胞膜中磷脂 有非特异反应;S-P法;抗原;二步法;二步法原理示意图 ;组织抗原;在辣根过氧化物酶（HRP）显色 过程中，过氧化氢是特异性底物，3，3二氨基联苯胺（DAB）是供氢体。HRP在分解过氧化氢的过程中，与过氧化氢形成复合物，再与电子供体形成聚合体，在酶反应部位形成不溶性棕褐色沉淀。;直接法;谢谢！;附加知识