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课件:口腔粘膜细胞基因组制备.ppt
可编辑 可编辑 分子医学技能实验 袁 洁 yuanjie@ 实验一 口腔粘膜细胞基因组DNA制备2010.9.19 基因组DNA的提取通常用于构建基因组文库、Southern杂交(包括RFLP)及PCR分离基因等。 是一般的基因工程实验中DNA操作的最初步骤。 一、基因组DNA的提取与纯化 目的: 核酸分离纯化的总原则: ? 保证核酸一级结构完整 ? 排除其它分子的污染: 细胞内:蛋白质、脂类、糖、RNA等 提取过程中:有机熔剂、金属离子、外源DNA 细胞样品的核酸提取的主要步骤 破碎细胞 去除细胞内的其它分子: 蛋白质 多糖 脂类 去除盐类、有机溶剂等杂质 核酸提取注意事项 减少化学因素对核酸的降解 如过量酸碱 减少物理因素对核酸的降解 机械剪切力:强烈震荡、渗透压急剧改变、反复冻融 高温 防止核酸的生物降解 核酸酶的预防 二、人基因组DNA的制备 实验目的及意义: 从人口腔上皮细胞中提取纯的基因组DNA 掌握基因组DNA抽提的方法,理解核酸分离纯化的基本原理 分离纯化基因组DNA的常用方法: 不同生物(植物、动物、微生物)的基因组DNA的提取方法有所不同,分离方法也有差异。主要根据不同细胞的特点而有区别,但原理相似,因此它们有共同的步骤: 裂解细胞:SDS裂解细胞,EDTA抑制核酸酶 除去蛋白质:蛋白酶K水解蛋白质,酚和氯仿/异戊醇抽提、分离蛋白质; 析出DNA:乙醇沉淀使DNA从溶液中析出。 实验材料及试剂 材料:人口腔上皮细胞 试剂: 抽提缓冲液:Tris-Cl pH8.0 ,EDTA,NaCl, RNAase, SDS,蛋白酶K 水饱和酚 氯仿/异戊醇(V/V=24:1) 75%乙醇、95%乙醇 TE缓冲液:Tris,EDTA 主要试剂的功能 抽提缓冲液:由SDS、EDTA、蛋白酶K组成 SDS的作用是裂解细胞 EDTA 的作用是络合掉镁等二价金属离子,防止DNA酶对DNA分子的降解作用。 蛋白酶K的作用是水解蛋白质。 酚和氯仿/异戊醇:抽提分离蛋白质 乙醇:沉淀DNA TE:溶解DNA THANK YOU SUCCESS * * 可编辑 取材:用生理盐水漱口后,口含生理盐水10~15ml约2~3min,用15ml离心管(4000rpm ? 10min)收集细胞沉淀 ① (离心机的使用,平衡) ? 加入0.5ml抽提缓冲液,重悬沉淀 ,转移至1.5ml EP管 (微量移液器的正确使用) 混匀,65℃ 温育30min ? 加入等体积的饱和酚(0.5ml),充分颠倒混匀 (不要震荡!) P13 实验步骤及注意事项(一人一组): 12000rpm?5min②,上层水相转移至新的EP管 (高速离心机的使用与安全意识)? 加入等体积氯仿/异戊醇,颠倒混匀 12000rpm?5min,上层水相转移到新的EP管 ? ? 加入2倍体积95%的乙醇,颠倒混匀 12000rpm?10min ③? 弃上清,沉淀中加入75%乙醇 ? 12000rpm?2min ④ ? 轻轻弃去上清,打开EP盖,室温静置5~10min 加入30?l0.1×TE溶液,充分混匀后检测结果? 分子医学实验注意事项 微量移液器的正确使用 离心机的正确使用 上课纪律 撰写实验报告的规范 实验结果及其分析 ? 定性分析:DNA琼脂糖凝胶电泳 ? PCR-SSCP 多态性分析 下次实验课进行 常见问题: 1、提取的DNA不纯: 变性不充分;关键过程反应时间过短; 离心时间或速度不够。 2、提取的DNA成涂布状: 操作过程中用力过猛,动作粗暴; 操作系统有污染。 3、与细胞器DNA分离不全; 变性过程不完全; 试剂配置问题。 THANK YOU SUCCESS * * 可编辑 可编辑 可编辑
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