水稻RAC K1蛋白的定位研究课程设计.pptVIP

水稻RACK1蛋白的定位研究; WD40重复蛋白是一个具有高度保守基序但具有多种功能的大家族。异三聚体G蛋白β亚基属于WD40重复蛋白。Dell等通过酵母双杂交的方法发现了G蛋白βγ亚基可能的新效应分子，即活性C激酶1受体(Receptor for Activated C Kinase 1, RACK1)、动力蛋白中间链和一个未知功能的蛋白质(GeneBank登陆号为AAH20044)。这些蛋白质都具有WD40重复。 RACK1在广大物种中是高度保守的；研究发现，哺乳动物和植物中都存在RACK1同源物的踪迹，如猪、非洲爪蟾、鼠、大豆、山毛榉等。Chen JG等(2006)在分析鱼、昆虫和真菌的EST数据库和基因组时均发现了RACK1同源物。植物中第一个被发现的RACK1同源基因是烟草BY-2悬浮细胞中的一个生长素诱导基因arcA，之后在拟南芥、水稻、烟草、番茄、苜蓿和藻类中都发现了RACK1同源基因的存在。烟草和番茄中至少有两种RACK1同源物。 ; 报告基因是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，也就是说，是一个其产物非常容易被鉴定的基因。把它的编码序列和基因表达调节序列融合形成嵌合基因，或与其他目的基因相融合，在调控序列控制下进行表达，从而利用它的表达产物来标定目的基因的表达调控，筛选转化体。 目前研究中曾用过的报告基因有:β-半乳糖苷酶 (β-Lac ) ,氯霉素乙酸转移酶(CAT)、新霉素乙酞转移酶(NPII)、荧光素酶(Lux)、和β-葡萄糖苷酶(β-GUS )等。但这些传统的报告基因有着许多的不足。GUS基因所用的检测底物成本较高，且会对细胞造成毒害，染色中的一些物理，化学步骤会损伤细胞的超微结构，其中间反应的扩增也会影响葡萄糖苷酶本身的在细胞内的准确定位;以荧光素酶基因作报告基因检测时需加入荧光素，荧光素可在机体内随质流移动，使其往往难以准确地指示荧光素酶基因的特异性表达部位;而β-半乳糖苷酶基因作报告基因需要外源底物X-gal和诱导物IPTG的参与，故成本高，且操作繁琐。新霉素、氯霉素基因作报告基因的编码产物对转基因个体的幼胚存在一定的毒副作用。 ; 绿色荧光蛋白(GFP)是存在于发光水母体内，它是一种吸收蓝光或紫外光后发出绿色荧光的天然蛋白质。这种蛋白质在表达时可自身催化形成荧光基团，而且不需要添加任何底物或辅助因子，这样它就可以免除在检测时底物对细胞造成的一些物理、化学损伤，降低了添加的辅因子在对转基因个体进行观察时造成的假象，同时又降低了检测成本，简化了繁琐操作。 因此，在转基因研究中，利用GFP作报告基因则可以大大提高转基因动、植物的成功率，减少转基因个体筛选、鉴定方面的工作量。 ;选题意义; 本实验室以往的研究虽然证明rack1基因影响植物忍耐干旱的能力，通过研究水稻rack1过表达植株及突变体植株得知，OsRACK1与水稻抗旱能力成正相关，但对其机理不是很清楚。本研究试图从OsRACK1基因产物在细胞中的定位区域来探讨OsRACK1基因的作用机理。;研究方案 ;研究技术路线;具体方法;(2)植物表达载体转化根癌农杆菌 EHA105;; （3）转化水稻 根癌农杆菌与水稻悬浮细胞共培养，在潮霉素和头孢的双抗性N6D2培养基上筛选转基因细胞。 （4）转基因水稻的亚细胞定位检测 用荧光显微镜对转基因水稻细胞进行荧光观察;实验可行性分析; 2. 现已成功从水稻中克隆出OsRACK1基因（附图1），gfp全长基因（附图2）也已获得并测序成功，相应表达载体本实验室也有保存。 ;附图2：; 3. 本实验所采取的技术路线是过去多年研究的基础上建立的，所涉及的实验方法、关键技术等也是实验室的常规方法，并且相应的仪器设备较齐全。 ;参考文献;11.Zeller, C.E., Parnell, S.C., and Dohlman, H.G. (2007). The RACK1 ortholog Asc1 functions as a G protein beta subunit coupled to glucose responsiveness in yeast. J. Biol. Chem. in press. 12. Assmann, S.M. (2005). G protein regulation of disease resistance