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mtt法测定聚乙烯亚胺的细胞毒素,实验报告 　　MTT法测定细胞生长曲线　　1、取生长状况良好的细胞，常规消化制成单细胞悬液并计数，调整细胞成六个浓度梯度，依次为：5x10、1x10、2x10、3x10、4x10、5x10/ml，均匀接种细胞于96孔细胞培养板，每孔加细胞悬。　　液200ul，每个浓度组设6个复孔,共接种7块培养板，37℃、5%C02浓度，饱和湿度培养箱中连续孵育24/48/72/96/120/148/172小时后。　　2、每孔加入20ulMTT溶液(smg/m1用PBS配)，继续孵育4h后终止培养。　　3、快速翻转培养板,弃去上清液,每孔加入150ulDMSO,振荡10min，使MTT蓝紫色结晶完全溶解。　　4、用酶联免疫检测仪于490nm处检测各孔的吸光值(OD值)，并以未接种细胞只加培养基孔的吸光值为空白对照调零，取6孔平均值。　　5、实验重复3次，以培养“时间”为横轴，“吸光值”为纵轴绘制细胞生长曲线。　　MTT实验法测定细胞增殖　　1.实验材料　　实验细胞株　　癌细胞株用含有10%新生小牛灭活血清RPMI-1640培养基，培养在37℃、饱和湿度、5%CO2的无菌培养箱中，每隔2～3天进行一次细胞传代。　　药物与试剂　　RPMI-1640培养基　　DMSO胰蛋白酶粉　　1-甲基乙内酰脲5-氟尿嘧啶　　MTT粉甘油　　碘化丙啶(PI)　　新生小牛血清　　仪器设备　　超净工作台超低温电冰箱恒温水浴箱低温高速离心机恒温震荡摇动床　　-20℃电冰箱光学显微镜电子天平Eppendorf移液枪去离子纯水仪流式细胞仪低温数控高速离心机普通离心机　　主要试剂配方　　PBS溶液　　磷酸二氢钾(KH2PO4)、氯化钠(NaCl)、磷酸氢二钠　　、氯化钾(KCl)，用去离子水(ddH2O)溶解，然后将其定容使总体积为。再使用盐酸将PH值调至，用无菌盐水瓶分装好，高压消毒灭菌，4℃内保存。临用前要在37℃水浴加热。　　细胞培养基　　称取RIPM-1640培养基粉，用ddH2O溶解，再往溶液中加入2gNaHCO3，再用盐酸将PH值调整至，采用抽滤法除菌，无菌盐水瓶分装，置于4℃冰箱中保存，使用前往瓶中加入灭活新生小牛血清，使每瓶培养基中灭活新生小牛血清的浓度为10%。每次临用前要将含有10%灭活新生小牛血清的RPMI-1640培养基置于37℃水浴箱中加热。　　新生小牛血清　　临用前，将新生小牛血清置于56℃水浴中灭活30min，之后用无菌盐水瓶分装密封，再置于-20℃冰箱中保存。　　胰蛋白酶　　在100ml的PBS溶液中加入胰蛋白酶粉，置于4℃冰箱中过夜，用直径为μm微孔滤膜除菌器除菌后分装、密封，置于4℃冰箱中保存。　　MTT溶液(5mg/ml)　　往50ml无菌PBS中加入250mgMTT粉，轻轻摇匀，使MTT粉充分溶解，予用直径为μm微孔滤膜除菌后分装、密封，锡箔纸避光，置于4℃冰箱中临时保存，置于-20℃冰箱中短期保存。　　4%多聚甲醛　　称取多聚甲醛4g溶于50ml蒸馏水中，然后加热至70℃左右，用玻璃棒搅拌溶液使多聚甲醛充分溶解，然后往溶液中逐滴加入浓度为1mol/L的Na0H至溶液澄清，冷却，蒸馏水定容至100ml，用盐酸将PH调至，锡箔纸避光，置于4℃冰箱中保存。　　苏木精染液　　蒸馏水700ml，甘油300ml，苏木精5g，碘酸钠，冰醋酸20ml，硫酸铝钾500g。　　伊红染液　　蒸馏水100ml，伊红，氯化钙。　　1-甲基乙内酰脲溶液的配制　　1-甲基乙内酰脲分子式为C4H6N2O2，分子量为，纯度%，吸取适量该药物，加入少量PBS或生理盐水，配制成500mg·L-1的母液。-20℃保存，临用时稀释。　　5-Fu溶液的配制　　5-氟尿嘧啶分子量为，分子式为C4H3FN2O2，规格为250mg/10ml，pH值为～，吸取适量该药物，加入少量PBS或生理盐水，配置成100mgL的母液。-20℃保存，临用时稀释。　　2.实验方法.　　细胞培养　　细胞复苏　　(1)从-80℃冰箱迅速取出冻存人结肠癌SW480细胞的冻存管，然后迅速投入37℃水浴箱中，轻轻摇动冻存管，使冻存管内容物迅速融化，取出后用75%酒精消毒，放入无菌操作台，在操作台中开启冻存管。用1000ul的移液枪吸出溶解的细胞悬液，注入离心管，同时往离心管中加入10倍10%灭活新生小牛血清RPMI-1640培养基，准备离心。　　(2)室温下，1000rpm，离心5min，用移液枪吸取离心管中上清液、弃去，然后用细胞培养液洗1～2次，弃去上清培养液后，加入1ml培养液，用吹打管轻轻吹打，使离心管底部的细胞悬于培养基中，形成悬浮液。　　(3)用培养液适当稀释悬浮液