北大医学部复习资料CRISPR操作系统(原理).docx

一图看破CRISPR操作系统！ 近日，Cell发表了一篇名为“SnapShot: CRISPR-RNA-Guided Adaptive Immune Systems”的精华文章，用一张图，就全解析了CRISPR系统的“中心法则”。今天就让麦子带大家分解此图，真正掌握时下这个可以对人、老鼠、斑马鱼、细菌、果蝇、酵母、线虫和农作物等细胞内的基因进行精确编辑的热门技术之精髓： CRISPR系统可以分为三种类型（I-III）及至少11种不同的亚型（I-A~I-F，II-A~II-C，III-A~III-B）。但是所有的CRISPR-Cas 免疫系统都是通过主要的三个阶段来行使功能： 外来DNA的采集 CRISPR RNA的生物合成 靶向干扰 CRISPR system have many types and subtypes. but all of CRISPR Cas system work through 3 stage: 第一阶段：外来DNA的采集（Foreign DNA Acquisition） 宿主通过Cas蛋白来识别外源核苷酸，入侵细菌的短片段DNA称为protospacers，它们作为间隔区序列插入到了宿主的CRISPR位点。在I和II型系统中，protospacers选择自入侵DNA旁出现PAM的区域（PAM：protospacer adjacent motif，对于CRISPR结合至关重要）。一般protospacers通过包含Cas1、Cas2和游离3-羟基等元件的机制连接在CRISPR位点的前导区(Leader)。Protospacer的整合也伴随着末端重新序列复制，这可能涉及宿主聚合酶和DNA修复机制。 The first stage is Foreign DNA Acquisition，host recognize foreign DNA by a protein called Cas. Short DNA fragment from invasion bacteria called protospacers, as spacer region sequence insert into CRISPR point in the host. In type I and type II, protospacers chose a PAM (protospacer adjacent motif ) region beside invasion DNA. Protospacers link to the leader of CRISPR point by a mechanism including Cas1、Cas2 and free 3’ hydroxyl etc. Protospacer copy accompany with end sequence, this may involved host’s polymerase and mechanism of DNA repair. 第二阶段：CRISPR RNA的生物合成（crRNA Biogenesis） CRISPRRNA的生物合成从转录开始，接下来是初级转录产物pre-crRNA加工生成一类短的CRISPR衍生RNAs（crRNAs），每一个都包含与之前遇到的外源DNA（Spacer序列）对应的互补序列。crRNA导向序列的两侧是相邻重复序列区域。在I型和III型系统中，初始CRISPR转录产物会被CRISPR特异性核酸内切酶（Cas6 或 Cas5d）在重复序列位点内切割。在许多I型系统中，重复序列是回文结构的，Cas6可以稳定连接在crRNA 3端茎环上。而在III型系统中，Cas6短暂与CRISPRRNA连接，crRNA的 3端会被未知的核酸酶进一步处理。 CRISPRRNA的加工在II型系统中依赖于包含一个与重复序列互补序列的反式作用 crRNA (tracrRNA)。这些双链的区域在Cas9存在时可以被RNaseIII加工，靶向干扰需要tracrRNA和 crRNA的同时存在。II型系统中的这两个RNAs可以融合成一个sgRNA，目前，II型系统是我们研究的“火力”较为集中的系统，而Cas9已经变成了在多种细胞类型和组织中靶向基因编辑的强大工具。 The first stage is crRNA Biogenesis. Biogenesis of CRISPRRNA start from transcription ,than primary transcription product pre-crRNA generate a kind of short crRNAs, everyone of that include complementary