生物制药S ephadexG-50分离核黄素与丙种球蛋白课程设计.pptVIP

SephadexG-50分离核黄素与丙种球蛋白 ;实验目的;核黄素又称维生素B2，在自然界分布广泛的一种维生素。是哺乳动物必需的营养物，其辅酶形式是黄素单核苷酸和黄素腺嘌呤二核苷酸。 核黄素水溶性较低，但在碱性溶液中容易溶解，在强酸溶液中稳定，光照及紫外照射引起不可逆的分解。核黄素在机体中有递氢的作用，并是机体中一些重要的氧化还原酶的辅酶。;维生素B2的生理功能 　　1、 参与碳水化合物、蛋白质、核酸和脂肪的代谢可提高肌体对蛋白质的利用率，促进生长发育。 　　2、 参与细胞的生长代谢，是肌体组织代谢和修复的必须营养素。 　　3、 强化肝功能、调节肾上腺素的分泌。 　　4、 保护皮肤毛囊粘膜及皮脂腺的功能。 　　5、 增强视力 作用机理 　　核黄素即维生素B2与特定的蛋白质结合生成黄酶。黄酶在物质代谢中起传递氢的作用，参与组织的呼吸过程。 　　核黄素的主要生理功用是作为辅酶促进代谢。核黄素和磷酸及一分子蛋白质结合成为黄色酶。这一类酶又叫脱氢酶，重要的是要非常介导的氢原子转移对糖、脂和氨基酸的代谢都很重要。它是许多动物和微生物生长的必需因素。 　　为防止核黄素短缺症，应注意保护食物中的核黄素。（吃面条的时候，三分之一到一半的核黄素进入了面汤） ;器材和试剂 1、凝胶 常用凝胶有三种，即葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶。分析于下。 （1）葡聚糖凝胶：葡聚糖凝胶是由葡聚糖经交联剂1-氯代-2，3-环氧丙烷聚合成的立体网状结构，有较大的吸水性，吸水后体积膨胀呈透明状，这时网眼张开，在水、盐、碱和弱酸溶液中有较好的稳定性，但强酸和氧化剂可使其解聚，使用时应注意避免。 葡聚糖凝胶孔隙的大小，可由制备葡聚糖凝胶时加入交联剂的量来控制，加入的交联剂多，糖长链间的交联就多，网状结构的孔隙就小，吸水量也小; 加入的少，则交联少，孔隙大，吸水量也大。市销葡聚糖凝胶的型号就是根据吸水量而定，即每克干胶吸水的克×10定为G类葡聚糖凝胶型号的标号。 ;（2）聚丙烯先胺凝胶：聚丙烯先凝胶是由丙烯酰胺经N,N-次甲基双丙烯酰胺交联聚合而成，其应用效果和葡聚糖凝胶相似。 （3）琼脂糖凝胶: 琼脂糖凝胶不需用化学交联剂聚合，主要依靠琼脂糖链间的次级键（如氢键）形成网状结构，其结构的疏密则由琼脂糖的浓度来控制。 葡聚糖凝胶的稳定性较差，但分离范围广，由血清巨球蛋白到亚细胞颗粒都可以得到分离。 2、层析柱 3、洗脱液 洗脱液的选用原则：对样品和柱床无损害：有利于层析后样品的浓缩或分析测定。;实验原理;凝胶色谱基本原理见图，含有不同分子大小的组分的样品进入凝胶色谱柱时，大分子物质由于分子直径大，不能进入凝胶的微孔内，只能分布于凝胶颗粒的间隙中，以较快的速度流过凝胶柱；较小的分子则能进入凝胶的微孔内，不断地进出于一个个颗粒的微孔内外，这就是小分子物质向下移动的速度比大分子的速度慢；而分子大小介于二者之间的分子在流动中部分渗透。这种在颗粒内部扩散的结果，使小分子在柱内移动速度最慢，中等分子次之，大分子移动速度最快，最先流出。样品根据分子大小的不同，按分子从大到小依次顺序从色谱柱内流出。凝胶介质像分子筛一样，将大小不同的分子进行分离，因而凝胶色谱又叫体积排阻色谱（Size excluding chrontography,SEC)。 ; 将含有三种不同分子量物质的混合样品用某种规格的凝胶柱进行分离。首先将样品小心自柱顶端加入，洗脱，以分步收集器收集洗脱液，测定每管物质浓度，然后以洗脱体积为横坐标，各物质浓度为纵坐标即得如下的洗脱曲线：由图可见最先流出的物质是，A，它的分子量最大，大于该种凝胶的排阻限(A物质分子的直径大于凝胶的孔径)，完全不能进入颗粒内部，只能从颗粒间隙流过，称“全排阻”。其流经体积最小，与外水体积VO相等。最后流出的物质是C，它的分子量最小，小于该种凝胶的渗入限，其分子可以自由进出凝胶颗粒，这叫“全渗入”。流经体积是外水体积VO与内水体积Vi的和。而物质B的分子量介于排阻限与渗入限之间，其分子能够部分地进入凝胶颗粒之中，不能全部地不受限制的通过，这叫做“部分排阻”或“部分渗入”。它的流经体积Ve是全部外水体积加上内水体积的一部分，即Ve=VO+KdVi 式中Kd称作“排阻系数”或“分配系数”。它反映了物质分子进入凝胶颗粒的程度。;Kd=(Ve-VO)／Vi 当Kd=1时，Ve=VO+Vi为全渗入。 当Kd=0时，Ve=VO为全排阻。 当0Kd1时，Ve=VO+KdVi为部分排阻。 如Kdt，则说明该物质分子与凝胶有吸附作用。 这三种物质的分离过程可见示意图如下：;Vi也可通过计算求出： Vi=aWr a=凝胶千重 Wi=每克干凝胶吸水毫升数 Vt=Vo+Vi+Vg Vg=凝胶骨架体积 Vt=可通过测定层析柱内径及高度