生物制药工 艺学-动物细胞工程制药教材编辑.ppt

动物细胞工程制药;第一节 概述;细胞工程的研究内容：;类型;;;;;;原核细胞与真核细胞之区别;通常将离体培养的细胞分为两类;1.贴壁细胞;2. 悬浮细胞;3. 兼性帖壁细胞;二、动物细胞的化学组成和代谢;三、动物细胞的生理特点;;;;;;;总结：动物细胞的生理特点;动物细胞生产药物;第三节 生产用动物细胞的要求和获得;一、生产用动物细胞的要求;二、生产用动物细胞的获得;1. 原代细胞;2. 二倍体细胞系;二倍体细胞系有正常细胞的特点;3. 转化细胞系;转化细胞系具有无限生命力，常常倍增时间较短，对培养条件和生长因子等要求较低，更适于大规模工业化生产。如Namalwa、CHO、BHK-21、Vero细胞等。 中国尚未成立细胞保存中心，细胞分散保存在各研究所。;4. 融合细胞系;细胞融合方法（诱导法）;细胞融合方法（物理法）;5. 重组工程细胞系;三、基因工程细胞的构建和筛选;1、真核细胞基因表达载体的构建;杆状病毒载体;;杆状病毒载体;昆虫杆状病毒表达系统表达过程;杆状病毒载体;杆状病毒作载体的优点;穿梭质粒载体一般含有如下基本成分;选择标记有两种;穿梭质粒载体一般含有如下基本成分;选择性增加拷贝数的扩增系统;穿梭质粒载体一般含有如下基本成分;2、基因载体的导入和高效表达工程细胞株的筛选;;;如何筛选工程细胞？;四、常用生产用细胞的特性;五、细胞库的建立;;生产用细胞库：从原始细胞库来，或从单一安瓿来，或从多个安瓿在融化即刻混合在一起的，然后经培养扩增到一定数量后，再分装储存形成的细胞库。 生产用细胞库也必须建立档案，而且需要进行无菌性和无细胞交叉污染的检查，生产时需确定其最高使用的传代数。 ;第四节 动物细胞的培养条件和培养基;一、动物细胞的培养条件;1. 器材的清洗和消毒;2. 水质;3. pH;4. 渗透压;5. 温度;6. 空气;二、动物细胞培养基的种类和组成;1. 天然培养基; 用成分明确的化学试剂配制成的培养基。 优点：成分明确，组分稳定，可大量生产供应 其组成大致如下： ;单纯使用合成培养基，细胞常常不能很好增殖，甚至不能贴壁。因此在使用时常常需要加入一定量的动物血清，最常用的是5%-10%的动物血清。杂瘤细胞的培养对血清要求更高，常需10%-20%胎牛血清。;血清的作用机制;无血清培养基：合成培养基+不同种类的添加剂 添加剂大致有以下几类： 激素和生长因子： 各种激素、生长因子的功能 维持细胞的功能 保持细胞的状态（分化或未分化） 使用最多的是胰岛素，促进糖原和脂肪酸的合成，对细胞生长有刺激作用。;;无血清培养基的优点：;培养细胞的种类： 原代细胞培养 传代细胞培养 培养基不同： 液体培养 固体培养 培养容器和方式不同： 静止培养 旋转培养 微载体培养 中空纤维培养 固定化培养;一、细胞分离;消化液的用途：取材进行原代培养时需要将组织块消化解离形成细胞悬液；传代培养时将贴壁细胞从瓶壁上消化下来。 常用的消化液:胰蛋白酶、乙二胺四乙酸（EDTA）、胰酶-柠檬酸盐、胰酶-EDTA、胶原酶、链酶蛋白酶、木瓜蛋白酶等;二、细胞计数;血球计数板计数;2. 血球计数板计数;结晶紫染色细胞核计数法 原理：结晶紫染液属碱性染料，低渗，有螯合钙离子的作用，可使细胞分散解离和破碎，将细胞核染成蓝色。染色后取样在血球计数板上镜检，计数细胞核即细胞数。 ;MTT染色计数法 MTT:3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。是一种黄颜色的染料。 原理：活细胞内的线粒体脱氢酶能将MTT转变为不可溶性的紫色的甲臜结晶，可溶于二甲亚砜（DMSO）。 MTT结晶形成的量与细胞数成正比。用酶标仪在490nm处测定其吸光值，可间接反映活细胞数量。 灵敏度高；MTT有致癌性，DMSO极易渗透皮肤;三、细胞传代;贴壁细胞传代的注意事项;四、细胞的冻存和复苏;2.细胞的复苏（总的要求是快融） 注意事项： 操作中注意防护，戴面罩和手套； 从液氮中取出后，立即丢入37-40℃温水的搪瓷杯中，并搅动加速融化； 用乙醇消毒安踣外表； 尽早除去二甲亚砜，离心，换新鲜培养液； 隔天观察细胞生长情况，再换液一次。;总结;一、动物细胞大规模培养的方法 二、动物细胞培养的操作方式 ;一、动物细胞大规模培养的方法;1. 悬浮培养;2. 贴壁培养;3.贴壁-悬浮培养（假悬浮培养）;（1）微载体培养;微载体培养的优点：既可创造相当大的贴附面积供细胞贴附生长增殖，满足绝大多数细胞的基本要求，又由于载体体积很小，比重较轻，在轻度搅拌下即可携带细胞自由悬浮在培养基内，充分发挥了悬浮培养的一切优点。