生物制药第 十三节　基因工程药物制造实例教学精品.pptVIP

第十三节　基因工程药物制造实例; 2003年抗非典期间，江南大学与丽珠集团苏州新宝制药厂合作攻关，通过发酵工程和生物制药工程研制成功了重组人α-2b干扰素口鼻腔喷雾剂，解决了干扰素常温保存稳定性问题。在疫区特殊人群捐赠使用，效果显著。;一、基因工程菌的组建 诱生的白细胞 提取全RNA 通过寡dT-纤维素柱 蔗糖密度梯度 获得寡A的mRNA 离心提取12s 的 mRNA 逆转录成cDNA 双链cDNA接上dT或dG尾 pBR322质粒 pBR322质粒加上dA或dC ; 退火获的杂交质粒 转化大肠杆菌k12 扩增杂交质粒 筛选抗四环素但对氨苄 用已知干扰素的DNA片断作为 青霉素敏感细菌克隆 探针挑选富有干扰素cDNA克隆 将干扰素cDNA克隆入表达载体 在大肠杆菌 中进行高效表达; α2b干扰素生产过程 1.发酵 工程菌：SW-IFNα-2b/E.coli DH5α，质粒用PL启动子，含氨苄青霉素抗性基因。 种子培养基：1%蛋白胨0.5%酵母提取物0.5%NaCl。制备种子液作为发酵罐种子使用。; 发酵培养基：1%蛋白胨，0.5%酵母提取物，0.05%NaCl，0.01%NH4Cl等。发酵培养基加入氨苄青霉素，防泡剂。30℃发酵8h，然后在42℃诱导，2-3h可完成发酵。每隔不同的时间取发酵液，离心称量湿菌体。; 2.产品的提取与纯化 a冷却后离心，除上清液，得湿菌体悬浮于缓冲液中，冰浴条件下超声破碎； b离心，取沉淀部分；加尿素、缓冲液和二巯基苏糖醇溶液溶解。搅拌抽提2h，离心取上清。 c加入复性缓冲液，离心，除去不溶物。 d超滤器浓缩后，经Sephadex G50 分离。 e经SDS检查。 f再经DE-52柱纯化。 ;三、质量控制标准和要求;⑹残余外源性DNA含量测定 ⑺残余血清IgG含量测定 ⑻残余抗生素活性测定 ⑼紫外光谱扫描 ⑽肽图测定 ⑾等电点测定 ⑿除菌半成品应做干扰素效价测定、无菌试验、热原试验。;⒉成品检定;一章回顾;融合蛋白;质粒的结构不稳定;包含体;如何获得目的基因 基因表达的宿主菌有哪些？ 真核基因在大肠杆菌中表达的形式? 酵母细胞作为宿主细胞相对大肠杆菌来说有那些优点？ 制备基因工程药物的宿主应该满足那些条件？ 制备基因工程药物的基本过程 质粒不稳定的原因？;酵母细胞作为宿主细胞相对大肠杆菌来说有那些优点？;基因工程菌应该满足那些条件？;制备基因工程药物的基本过程;质粒不稳定的原因？;提高质粒稳定性的方法 影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素 实现高密度发酵的方法 包含体形成的原因 包含体的优势。 简述菌体生长与能量的关系 基因工程药物的质量控制包括那几个方面？ 基因工程药物怎样保存？;提高质粒稳定性的方法;影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素;实现高密度发酵的方法;包含体形成的原因;1、富集目标蛋白：包含体具有高密度，易于分离纯化的优势； 2、抗蛋白酶：重组蛋白以包含体的形式存在有效地抵御了大肠杆菌中的蛋白酶对目的蛋白的降解； 3、对宿主毒性小：生产那些处于天然构象对宿主细胞有毒害的蛋白有优势。;简述菌体生长与能量的关系 碳源通过有限的呼吸能力所提供的最大能量决定了菌体的最大比生长速率。当菌体生长所需能量大于菌体有氧代谢提供的能量时，由于呼吸链或三羧酸循环的供能不足，菌体会???生乙酸。必须控制菌体生长，从而控制乙酸的产生，减少它的抑制作用。 ;怎样保存基因工程药物？ ⒈ 液态保存 （1）低温保存：在-10到-20°C以下冰冻保存。 （2）在稳定pH条件下保存：调到稳定的pH 范围内 （3）高浓度保存：在高浓度时比较稳定。 （4）加保护剂保存：多元醇、有机溶剂、巯基乙醇 2、固态保存 含水量降到5%时，在室温或冰箱中保存均比较稳定。长期保存最好方法是制成干粉或结晶。放在干燥器中在4°C可保存相当长的时间。;1原材料的质量控制 2培养过程的质量控制 3纯化过程的质量控制 4目标产品的质量控制 5产品的保存;转录RNA为DNA的酶（ ） 能降解