生物化学- 有动画教材编辑.pptVIP

教 师：李伟国 资料收集：杨延玺 易胜 王涛 则巴古力 董兴 冯莹 赖照明 刘亚京 资料整合：杨林芳 吴菲菲 余星星 PPT制作：刘亮 讲 课：曾栋梁 生物化学实验设计报告 蛋白质的提取、纯化以及检测 钙调蛋白的简单介绍 钙调蛋白（英语：Calmodulin，又称钙调素、携钙素，简称CaM），是一种能与钙离子结合的蛋白质，普遍存在真核生物细胞中。钙调素由148个氨基酸组成（分子量为16700）；含有大量酸性氨基酸（有1/3是谷氨酸和天冬氨酸），为酸性蛋白质（等电点为4.3）。钙调素含有4个EF手结构片断，其中每一个都可以结合一个钙离子。 钙调蛋白是一种钙结合蛋白，存在于几乎所有的真核细胞中。它的作用是对任何微量的钙都能敏感地捕获。钙调蛋白只有在与Ca2+结合后才有活性。与钙结合后，CaM发生构型上的变化，成为一些酶的激活物。 因不含有易氧化的络氨酸、半胱氨酸，因此十分的稳定 实验设计框架 实验方法：热变性吸附层析法，基因重组大 肠杆菌法（论文无法下载） 蛋白检测：分为定性检测和活性检测 实验总结：总结当前实验 第 18 卷第 4 期Journal of Shanxi Teachers University Vol. 18 No. 42004 年 12 月Natural Science Edition 动物脑组织中钙调蛋白的分离纯化 袁丽环, 段江燕 实验方法 试剂准备： 新鲜鼠脑；标准钙调蛋白；PDE；Pipes； BufferA：10 mmol/L Pipes, 1 mmol/L EDTA, pH=7.0; BufferB：10 mmol/L Pipes, 1 mmol/L CaCl2, pH=7.0; BufferC：50 mmol/L Tris-HCl, 0.5 mmol/L NaCl, 10 mmol/L EDTA, pH=8.0; 测定Buffer：360 mmol/L Tris-HCl，360 mmol/L 咪唑，4.5 mmol/L MgAc2。 钙调蛋白的粗提取 取新鲜的鼠脑共20 g ， 切碎并于100 mL BufferA 中匀浆． 将匀浆液置100 ℃ 水浴中煮沸 3 min ， 冷却后离心 10000rpm， 60min. 取上清液调成2 mmol/L CaCl2 溶液。 取样，采用离心法： 钙调蛋白提取 粗样品的纯化：（吸附层析法） 装柱： 采用葡聚糖G -5 0 ( 分离蛋白质的范围在 1.5×103-3×104 ) 用蒸馏水浸充分膨胀( 3 h-4 h ) 后再装柱； 平衡： 用提取钙调蛋白的缓冲溶液BufferA平衡； 上样： 经过平衡的凝胶过滤柱。 当平衡液流动到与固定相表面一致时， 用滴管轻轻地把分离样品的溶液加到固定相表面， 要尽量避免冲毁基质． 加入样品液的体积一般应少于床体积的1/2; 洗脱： 待样品液的液面流到固定相表面时， 用50 mL BufferB 淋洗之后用200 mL 0.5 mol/L NaCl 的BufferB淋洗， 最后用BufferC洗脱； 收集： 在进行洗脱的同时柱的下端与部分收集器接通。按时间分管收集，每管滴2 min ，流速控制在大约1.5 mL/ min。 钙调蛋白的定性检测 如图，倘若两者最大吸收峰以及峰形基本重合，那么可以判断该物质即为钙调蛋白 采用紫外光谱法： 钙调蛋白的活性检测 根据磷酸二酯酶( PDE) 可特异地把环核苷酸水解为 5’- 核苷酸, 并在蛇毒中的核苷酸作用下, 进一步水解成腺苷和磷酸. 而钙调蛋白可以激活 PDE, 从而使最终的产物无机磷的量增加, 因此可依据磷的含量判断钙调蛋白的生物学活性. 机理图如下 对活性的计算存在以下定量关系： 采用PDE法： 培养CaM基因重组大肠杆菌,并用IPTG诱导CaM表达,将菌体冻融、超声破碎,再经三氯醋酸、硫酸铵沉淀及超速离心 * * * *