生物技术制 药第五章 动物细胞制药教学精品.pptVIP

第五章 动物细胞制药 ; 1665年英国物理学家虎克(Hooke)用自制的显微镜发现了细胞，实际上是死细胞留下的细胞壁，不久，荷兰科学家列文虎克(Leeuwenhoek)才真正观察到了细胞。从此认为细胞是一切动植物体结构和功能的基本单元，并创立了细胞学说 ; 细胞虽小（直径约10μｍ），但其结构复杂而精细，分工明确，并且具有巨大的生产能力，于是出现了组织或细胞培养; 组织或细胞培养;第二节 动物细胞的形态和生理特点 ;一、动物细胞的形态 ;1.贴壁细胞 生长时必须有给以贴附的支持物表面，细胞依靠自身分泌的或培养基中提供的贴附因子才能在该表面上生长和繁殖，细胞在表面上生长时有两种形态 成纤维样细胞型：主要来源于中胚层组织细胞，如心肌细胞、平滑肌细胞、成 骨细胞等 上皮样细胞型：主要来源于外胚层和内胚层组织细胞，如皮肤细胞、肠管上 皮细胞 在培养过程中，随着培养条件的变化细胞形态也会发生改变2.悬浮细胞 细胞的生长不依赖支持物表面，在培养液中悬浮生长，如淋巴细胞等。3.兼性贴壁细胞 细胞根据生长条件的不同可贴壁也可悬浮生长，如中国地鼠卵巢细胞 ;二、动物细胞生理特点 ;4.动物细胞对周围环境十分敏感 物理化学因素，如渗透压、酸度、离子浓度、剪切力、微量元素等的变化都会影响其生长，这是由于动物细胞没有细胞壁的保护，所以更敏感 5.动物细胞对培养基要求很高 原核生物只要有碳源、氮源和无机盐就可以生长；而动物细胞不仅需要12种必需氨基酸、8种以上维生素多种无机盐和微量元素、葡萄糖外，还需要多种细胞生长因子和贴壁因子 6.动物细胞中蛋白质的合成途径和修饰功能与细菌不同 动物细胞蛋白质的合成在游离核糖体及与糙面型内质网结合的核糖体上都可以进行，内质网上合成的蛋白质多数为糖蛋白，需要糖基化，而细菌细胞则没有糖基化过程 所以动物细胞在生产活性蛋白是较原核细胞更有优势;优点：产物多半可分泌到细胞外，提取纯化方便，蛋白质经糖基化修饰 后与天然产物更一致，适合于临床应用 缺点：培养周期长、条???要求高、成本高、产量低;第三节 生产用动物细胞的要求和获得 ;一、生产用动物细胞的要求 ;二、生产用动物细胞的获得 ;三、常用生产用动物细胞的特性 ;四、基因工程细胞的构建和筛选 ;1.真核细胞基因表达载体的构建 ;构建穿梭质粒载体应具有的基本成分 ①允许载体在细胞内扩增的质粒序列 ②含有能使基因转录表达调控元件 ③能用以筛选出外源基因已整合的选择标记 ④有时还带有选择性增加拷贝数的扩增系统 ;2.基因载体的导入和高效表达工程细胞的筛选 ;五、细胞库的建立 ;第四节 动物细胞的培养条件和培养基 ;一、动物细胞在体外培养所需条件 ;二、动物细胞的培养条件;三、动物培养基的种类和组成 ;1.天然培养基; 组成稳定、可大量生产供应。成分为氨基酸（细胞合成蛋白质的原料）、维生素（维持细胞生命活动的低分子活性物质，形成酶的辅基或辅酶）、糖类（碳源）、无机盐（保持细胞的渗透压并参与代谢）、其他（前体和氧化还原剂） 合成培养基中除了各种营养成分外，还需添加5%-10%的小牛血清，才能使细胞很好地增殖 添加小牛血清的作用： ①提供有利于细胞生长增殖所需的各种生长因子和激素 ②提供有利于细胞贴壁所需的贴附因子和伸展因子 ③提供可识别金属、激素、维生素和脂类的结合蛋白 ④提供细胞生长所必需的脂肪酸和微量元素 ;3.无血清培养基 ;第五节 动物细胞培养方式和操作方式 ;一、动物细胞的大规模培养方法 ;1.悬浮培养 适用条件：非贴壁依赖性细胞 优点：操作简单、培养条件均一、传质和传氧比较好，容易扩大培养规 模，可借鉴细菌发酵的经验 缺点：体积小，较难采用灌流培养。常用反应器为搅拌和气升式 2.贴壁培养 适用条件：贴壁依赖性细胞和兼性贴壁细胞 优点：适用的细胞种类多，较容易采用灌流培养，使细胞达到高密度 缺点：操作比较复杂，需要合适的贴附材料和足够的面积，培养条件不 易均一，传质和传氧较差 ;3.贴壁-悬浮培养 ;二、动物细胞培养的操作方式 ;第七节 动物细胞制药的实例 ;组织纤溶酶原激活剂生产工艺 ;1.工艺流程 ;2.工艺过程 ;（2）tPA抗体制备：取人tPA或猪心tPA免疫家兔，按每只家兔2000-300微克计，用福式完全佐剂充分乳化注入家兔皮下，每隔两周再用100微克tPA加强免疫，共加强两次。然后取家兔血清，用50%硫酸胺盐析，沉淀于0度对生理盐水透析及Sephadex 75