生物化学实 验课程设计.pptVIP

生物化学实验;实验要求;实验原理;实验内容与结果;实验要求;实验原理;实验内容与结果;实验三;实验要求 ;一、蛋白质的等电点测定;二、蛋白质的沉淀反应;操作 1．蛋白质的盐析作用 2．重金属沉淀蛋白质 3．有机酸沉淀蛋白质 4．有机溶剂沉淀蛋白质 5．生物碱试剂沉淀蛋白质 ;实验四;实验要求;实验原理;(二) 血清蛋白聚丙烯酰胺凝胶垂直板状电泳 利用聚丙烯酰胺凝胶作电泳支持物。聚丙烯酰胺凝胶是一种人工合成的凝胶，是由丙烯酰胺单体和少量交联剂在催化剂、加速剂的作用下发生聚合反应而制得的，利用电泳和分子筛的双重作用分离物质，分辨力较高。血清蛋白在纸上电泳可分为5~7个组分，而在聚丙烯酰胺电泳上可分出12~25个组分。 ;实验内容;（二） 血清蛋白聚丙烯酰胺凝胶垂直板状电泳 1．凝胶板的制备：板状电泳槽按要求夹好、固定，用1%琼脂封边，并按比例配制凝胶，灌入凝胶板。 2．样品的准备：样品中加入样品稀释液，内含溴酚兰为示踪染料。 3．电泳：将上电泳槽的电极接电泳仪的负极，下电泳槽接正极，调节电压为150伏，电泳约1小时。 4．剥胶 5．固定、染色、脱色 ;实 验 结 果;实 验 五;实验要求;实 验 原 理;实验内容与结果;实 验 六;实验要求;实 验 原 理;酶分离纯化后需测定活力。比活性是指单位重量的酶蛋白样品中所含的酶活性单位，随着酶蛋白逐步纯化，其比活性将随之升高，因此测定酶的比活性可鉴定酶的纯化程度。 AKP属水解酶，在碱性条件下（pH9～10）能水解多种磷酸酯。以磷酸苯二钠作为酶的底物，水解产生的酚与4-氨基安替比林作用，经铁氰化钾氧化可产生红色醌类衍生物，根据红色深浅通过分光度法测定酶活性。 AKP蛋白含量用考马斯亮蓝法测定。考马斯亮蓝能与蛋白质结合生成蓝色复合物，在一定浓度范围内，蛋白质含量与颜色深浅成正比。;实验内容与结果;（二）AKP比活性测定 1、 样品酶活性测定： 酶活性单位计算：在37℃下保温15分钟产生1毫克酚，称为该酶的1个活性单位（U）。 计算每毫升酶液的酶活性单位（U/mL） 2、样品酶蛋白含量测定： 计算每毫升酶液的蛋白含量（mg/ml） 3、比活性计算： 比活性（ U/mg）=每毫升酶液的酶活性单位/每毫升酶液的蛋白含量 4、注意事项： 注意各阶段的稀释倍数及取样量。 各管加样量要准确，注意反应时间。;实 验 七;实验要求;实 验 原 理;酶的活力受环境pH的影响极为显著。通常只有在一定的pH范围内，酶才表现其催化活性，且在某一pH时，酶的活性才达最大值，称为最适pH值，不同酶的最适pH值不同。 在温度、pH及酶浓度恒定的条件下，底物浓度对酶的催化作用有很大的影响。一般情况下，当底物浓度很低时，酶促反应速度（V）随底物浓度（[S]）的增加而迅速增加；但当底物浓度继续增加时，反应速度的增加率就比较小；当底物浓度增加至某种程度时，反应速度达到一个极限值（Vm）。 Km值是酶的一个特征常数，是反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度。Km可以近似表示酶与底物的亲和力，测定Km是酶学研究的一个重要方法。 ;实验内容;实验结果;实 验 八;实验要求;实 验 原 理;实验内容与结果;实 验 九;实验要求;实 验 原 理;DNA含量测定： DNA具有吸收紫外光的性质，吸收高峰在260毫微米波长处。核酸的消光系数（或吸收系数）用ε(p)表示，即每升含有一克原子核酸磷的光吸收值（即A值），因此，用紫外分光法测定核酸含量时规定：在260毫微米波长下，每毫升含1微克DNA溶液的消光值（即O.D.260）为0.020,而每毫升含1微克RNA溶液的O.D.260值为0.022,故测定未知浓度DNA溶液的O.D.260，即可计算出DNA的含量。 DNA被酸水解后生成的脱氧核糖可以与二苯胺试剂一起加热产生蓝色反应，在595毫微米处有最大吸收。DNA在40~400微克范围内，光密度与DNA浓度成正比。;实验内容与结果 ;2、DNA含量测定： 紫外吸收法 二苯胺显色法 计算DNA的含量 ;实验十;实验要求;实验原理;实验内容与结果;结 束