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紫杉醇提取分离方法的研究 制药082 胡丽丽 108044047 紫杉醇是红豆杉属植物中的一种复杂的次生代谢产物, 也是目前所了解的惟一一种可以促进微管聚合和稳定已聚合微管的药物。同位素示踪表明, 紫杉醇只结合到聚合的微管上, 不与未聚合的微管蛋白二聚体反应。细胞接触紫杉醇后会在细胞内积累大量的微管，这些微管的积累干扰了细胞的各种功能,特别是使细胞分裂停止于有丝分裂期，阻断了细胞的正常分裂。 通过Ⅱ-Ⅲ临床研究，紫杉醇主要适用于卵巢癌和乳腺癌，对肺癌、大肠癌、黑色素瘤、头颈部癌、淋巴瘤、脑瘤也都有一定疗效。 发现历史 　　1963年美国化学家瓦尼（M.C. Wani）和沃尔（Monre E. Wall）首次从一种生长在美国西部大森林中称谓太平洋杉（Pacific Yew）树皮和木材中分离到了紫杉醇的粗提物。在筛选实验 中，Wani和 Wall发现紫杉醇粗提物对离体培养的鼠肿瘤细胞有很高活性，并开始分离这种活性成份。由于该活性成份在植物中含量极低，直到1971年，他们才同杜克（Duke）大学的化学教授姆克法尔（Andre T. McPhail）合作，通过x-射线分析确定了该活性成份的化学结构——一种四环二萜化合物，并把它命名为紫杉醇（taxol）。 虽然紫杉醇的全合成巳获成功，但就目前临床供药而言，主要还是依靠从植物中提取。无论是从天然的红豆杉植物还是从培养的植物细胞组织中提取紫杉醇，都要涉及到如何能分离并去掉与紫杉醇结构相似的其它紫杉烷类化合物。由于这些紫杉烷类化合物在化学结构和极性等方面都同紫杉醇极为相似，因此给分离工作带来很大的困难。 一、提取： 紫杉醇的提取方法，其效果直接影响紫杉醇分离、纯化的难度及最终产量。 粗提多采用甲醇、乙醇、甲醇一二氯甲烷(1：1)，但所得浸膏中杂质量较高。研究发现，在乙酸乙酯、乙醚等溶剂中，乙酸乙酯一丙酮(1：1)混和溶剂提取紫杉醇效果最佳，浸膏中紫杉醇含量高达甲醇提取的3倍。 常用的方法有冷浸、渗漉和索氏提取法，又有人在提取过程中引入超声和微波技术 ，从而大大缩短了提取时间。 二、萃取 目前，紫杉醇的萃取方法主要有以下几种 ： 液液萃取法 (Liquid—Liquid Extraction，LLE) 操作简单，但提取物含杂质量多，回收率不高 固液萃取法(S0lid Phase Extraction，SPE) 省时间、省溶剂、萃取效率高以及有更好的选择性等优点的新型萃取方法，固而倍受青睐。 Supelc固相萃取法 可快速去除样品中的与被分离物极性相差较大的杂质，氧化铝固相柱的萃取效果最好。 超临界流体萃取法 具有流程简单，时间短、无溶剂残留的特点，但是对设备要求高，生产成本高，因而应用受到了限制。 三、分离 目前，紫杉醇的分离方法主要有以下几种： 柱层析法 柱层析法是目前分离紫杉醇最常采用的方法，包括正相的硅胶、氧化铝柱层析，反相的C18 柱层析以及吸附的大孔树脂等。其中碱性氧化铝柱层析在分离紫杉醇中的表现突出。 薄层层析法 利用TLC的梯度展开来分离紫杉醇，将粗提液在薄层板上进行两梯度展开，可使紫杉醇与其它紫杉烷类达到满意的分离效果。结论：分离不完全。 制备型高效液相色谱 用Zorbax SW—Taxane柱无论在正相和反相条件下都有较好的分离效果，纯度可达98％ 。但由于HPLC制备量小，应用受到限制。 化学反应法 用化学反应的方法将cephalomannine的性质改变而保持紫杉醇的性质不发生改变，使得二者容易分离。0sO4能选择性的氧化cephalomamline[5]，使之成为醇，而紫杉醇却不受影响，这种方法有较好的效果，可使紫杉醇的纯度达到95％ ，但因毒性大而不能应用于实践 。 四、精制 活性碳脱色，重结晶，由于紫杉醇不溶于水，因此可通过向脱色液中加水的方法结晶出紫杉醇，加水量随溶液中产物的浓度不同而变化，应控制在溶液微显混浊时停止加入，静置一夜后可得白色棉花状结晶。结晶产物经过滤后用甲醇一水重结晶二次，后经真空干燥后得到白色针状结晶物。 五、实验优化： 1)粉碎： 由于紫杉醇具有热敏性．粉碎室内的温度一般不能超过60℃，固而采用功率和容量尽量大的粉碎机，粉碎的粒度以40目左右为宜。 (2)提取： 乙酸乙酯一丙酮(1：1)混和溶剂提取紫杉醇效果最佳，浸膏中紫杉醇含量高达甲醇提取的3倍。 (3)萃取： 利用CO2超临界流体萃取法，加入甲醇或乙醇作为夹带剂，可使红豆杉树皮中的大部分紫杉醇得到有效提取，回收率达85％ ，选择性好，杂质少。 (4)分离： 柱层析法是目前分离紫杉醇最常采用的方法，其中碱性氧化铝柱层析在分离紫杉醇中的表现突出。 (5)精制： 活性碳脱色，重结晶，由于紫杉醇不溶于水，因此可通