百日咳杆菌毒素.doc

百日咳杆菌毒素 自从1909年发现百日咳杆菌对热不稳定毒素（heat-labile toxin, HLT）或称皮肤坏死毒素后，百日咳杆菌的活性物质不断被分离和提纯，其中与致病有关的物质陆续被发现。与百日咳杆菌致病有关的物质除荚膜外，尚有百日咳杆菌的菌毛成分、内毒素（endotoxin）、百日咳毒素（pertussis toxin, PT）和腺苷酸环化酶/溶血毒素（adenylate cyclase/hemolysin toxin, ACT）等：内毒素即百日咳杆菌脂多糖（LPS）；百日咳毒素由于其多重作用而有不同的命名，如因能提高小鼠对组织胺、5-羟色胺等的敏感性而被称作组织胺敏感因子（histamine-sensitizing factor, HSF），因能促进白细胞、淋巴细胞增生又被称作白细胞增生因子或称淋巴细胞增生因子（leukocytosis promoting factor, LPF），因能使百日咳杆菌粘附于呼吸道纤毛上而使细胞损伤导致阵发性咳嗽又被称作气管细胞毒素（tracheal cytotoxin, TCT）；ACT能促进巨噬细胞内的cAMP增加而抑制巨噬细胞功能，而且此环化酶毒素又能活化胰岛B细胞导致大量胰岛素分泌而有被称作胰岛素活化蛋白（islets-activating protein, IAP）；百日咳杆菌有菌毛血凝素（fimbrial hemagglutinin, FHA）和白细胞增生因子-血凝素（lymphocytosis-promoting factor hemagglutinin, LPF-HA），使病人淋巴细胞增多，两者对小鼠均有免疫保护活性。近年对百日咳杆菌的研究热点主要集中在调控百日咳毒素表达的天然启动子和百日咳疫苗的研制上。现将起主要毒素及疫苗的研究进展分述如下。 内毒素(1-3) 百日咳杆菌脂多糖又称耐热毒素，是百日咳杆菌的被膜成分。与其他细菌的内毒素同样，其介导活性的主要部分为LPS的类脂A（lipid A）结构。 化学性质 早期采用热酚/水法提取百日咳杆菌的LPS（Westphal et al, 1952），以后有人用超速离心进行纯化并用各种蛋白酶处理以得到高纯度的LPS，各种不同菌株获得的LPS产量为6~34mg/g细菌干重。 百日咳杆菌内毒素的主要特征是含有两种不同成分的LPS，分别称作LPS-Ⅰ和LPS-Ⅱ。LPS-Ⅰ和LPS-Ⅱ两者比例为2：3。两组分均存在于百日咳Ⅰ相菌和部分Ⅳ相菌。这两组分的差别在于分子的类脂部分不同，一种分子的类脂连着2-3个脂肪酸而另一种含有3-5个脂肪酸，而且脂肪酸的组成也较特殊，含有罕见的2-甲基-3-羟基葵酸和2-甲基-2-羟基四葵酸，其他的成分如磷酸盐、葡萄糖胺、四葵酸、3-羟基四葵酸和3-羟基葵酸大致一致。类脂部分与多糖以3-脱氧-2-辛酮糖酸（KDO）分子相连，但KDO分子在两种LPS中磷酸化程度不同。将百日咳杆菌LPS用4mol/L HCl在100℃水解，得到一种含分支的三糖，即4-O-（2-氨基-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖基）-6-O-（2-氨基-2-脱氧-α-D-吡喃半乳糖基尿嘧啶）-D-吡喃葡萄糖。此分子皆存在于两种LPS中。用质谱法精确测定百日咳杆菌LPS的类脂部分的分子量，结合31P-NMR的结果推断的百日咳杆菌类脂A的结构见图1。 百日咳杆菌LPS的毒性 百日咳杆菌LPS具有明显的致热原性、Shwartzman反应、佐剂活性并具有增强对感染的非特异抵抗力活性等，现将百日咳杆菌LPS的活性小结于表1。 表1 百日咳杆菌LPS的生物学活性 试验方法 结果 小鼠体重增长试验（18-20g小鼠） 注射24h，体重改变的最大剂量为1.07μg 家兔热原性试验 2μg/kg剂量，最大平均升高温度为2℃ 家兔局部Shwartzman反应 阳性反应的敏感剂量介于12.5-200μg 保护反应：诱导小鼠对伤寒、大肠杆菌、肺双、绿脓杆菌和金葡菌感染的非特异性抵抗力（LPS和各菌攻击，相隔3天） LPS剂量在12.5-200μg，对所有攻击菌具有显著保护作用，最大保护作用是对肺双，最弱保护作用是对绿脓 佐剂作用：在流感病毒疫苗对小鼠的佐剂活性 抗病毒血凝素抗体年度增高2.5倍 二．对热不稳定毒素(4) 百日咳杆菌培养于合适的固体或液体培养基中，从陈旧培养基的上清液或新鲜收集的百日咳杆菌破碎后离心所得的上清即可得到HLT。 HLT的理化性质 在不同型分离得到的HLT含量和毒性不一，光滑型新分离培养物含有较大量毒素，而小菌落变种具有高度毒性。从新鲜细菌破碎提取的HLT毒性较强。提取的流程如下： 6% NaCl洗下培养于马铃薯甘油血培养基的百日咳杆菌→35℃干燥3天→与NaCl结晶混合磨成粉→高速离心→DEAE-纤维素吸附，在pH值7.1下0-1