十牙乳头细胞培养操作步骤牙胚细胞培养可参见此方法.DOCVIP

十三、牙乳头细胞培养操作步骤（牙胚细胞培养可参见此方法） 1、组织取材： （1）出生后4~7d的SD仔鼠，脱颈处死，75％乙醇消毒10min，断头后PBS漂洗2~3遍。 （2）超净台内分离上、下颌骨，用挖匙取出上下颌第一磨牙胚（大小约1mm3），分离牙胚的外层硬组织和牙乳头软组织，手术刀切碎或眼科剪剪碎牙乳头组织，备用。 2、原代培养 （1）酶消化法： 1）组织碎块置于0.3%（3mg/mL） I型胶原酶中，37℃孵箱消化40-60min，中途可吹打1次以离散组织。 2）消化结束时反复吹打200次后，加适量DMEM稀释胶原酶，800rpm离心6min，弃上清，沉淀用DMEM洗涤2次，每次1000rpm离心2min，弃上清以洗净残余胶原酶。 3）沉淀物加入含血清DMEM培养液充分混匀，反复吹打以机械力离散细胞团块，并通过200目细胞筛网，获得单细胞悬液。 4）用含血清DMEM调整细胞浓度为1×104/mL接种于25cm2培养瓶。 5）常规条件下培养，第2d全量或半量换液，弃去未贴壁的细胞，以后每3d换液1次，约5~7d即可达90%汇合，进行1：1传代。 （2）组织块法： 1）用眼科镊将组织碎块移入25cm2培养瓶，并用探针将组织块均匀铺于培养瓶底，组织块间距5mm左右，每个培养瓶接种20~30块为宜，并将瓶底倒置。 2）加入2mLDMEM培养液，37℃孵箱倒置培养2h~4h后，慢慢翻转培养瓶使瓶底正放，动作要轻，让液体缓缓覆盖组织块。常规培养24h加足培养液量至5mL，以后每3d换液，铺满瓶底达70%时，以1：1传代继续培养。 3、传代培养： 0.25%胰酶37℃消化约5min, 加等量含血清DMEM中止消化，800rpm离心6min，弃上清，首次传代比例为1：1，以后各代以1:2或1:3传代。 注意事项： 牙乳头细胞酶消化法原代培养时密度依赖性很强。 大鼠牙乳头细胞传代后易用含2%胎牛血清的DMEM培养基，并添加牛脑垂体提取液（BPE）。 酶消化法和组织块法培养原代细胞优缺点：酶消化法酶本身对细胞有一定的损伤，失去一些膜受体，影响细胞的功能和状态，且接种时细胞的密度依赖性较强，但细胞分离量多且易于满足实验要求；组织块法简单，对细胞损伤少，不存在胶原酶的影响，但细胞增殖速度较慢，所得细胞数量较少，不能满足在短期内获取大量细胞的实验需求。 其它注意事项参见牙髓细胞的培养。