普通PCR及测序PCR原理分解.pptVIP

逆转录反应的一般步骤 RNA模板+反转录引物，70℃，5min, 冰浴1min。 再加以下反应组分： Buffer dNTP 逆转录酶抑制剂 逆转录酶 以上组分加好后，混匀，42℃或37℃ 60min。 70℃，5min 后再冰浴，所得产物就是cDNA， cDNA用做后面的PCR的模板。 * 一步法： 利用同一缓冲液，在同一体系中加入逆转录酶、引物、Taq酶、4种dNTP 直接进行mRNA反转录与PCR扩增。发现Taq酶不仅具有DNA多聚酶的作用，而且具有反转录酶活性，可利用其双重作用在同一体系中直接以mRNA为模板进行反转录和其后PCR扩增，从而使mRNA的PCR步骤更为简化。所需样品量减少到最低限度，临床小样品的检测非常有利。用一步法扩增可检测出总RNA中小于1ng的低丰度mRNA。该法可用于低丰度mRNA的cDNA文库的构建及特异cDNA的克隆，并有可能与Taq酶的测序技术相组合，使得自动反转录、基因扩增与基因转录产物的测序在单管中进行。 * 两步法： 由于单管反应时RT和PCR都不能在最佳条件下进行并且 容易相互干扰，常只适宜用基因特异引物扩增较短的基因，及定量PCR。两步法则是将RT和PCR分别进行，这样使得两个