鸡胚背根神经节体外三维培养的实验研究-外科学(骨科)专业论文.docxVIP

y 10020]9声明本人声明所晕交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究：L作及l取得的 肼窀成粜荆我所知，除了文中特别加以标注和致{射的地方外，论文中不包含其 他人U经发表或撰写过的研究成果，也不包含获得四川大学或其他教育机构的学 位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在 论文中作了明确的说明并表示感谢。 。本学位论文成果是本人在四川大学滇。辂期问在导师指导1F取得的，沦文成果9例Ji!人学所仃，特此J哲明。申请人 指导教师用川人学临床茨学七年制学位论文李夏●鸡胚背根神经节体外三维培养的实验研究中文摘要目的：本研究通过选取两种已被广泛应用子骨组织工程领域的藻酸钙和 琼脂糖水凝胶作为细胞外基质材料，对鸡胚背根神经节(DRG)组织块进 行体外三维培养，以探讨藻酸钙及琼脂糖水凝胶作为导向支架材料用于 神经组织工程领域的可行性，并为上述材料的进一步改良提供必要的体 外实验依据． 方法(1)将2．59藻酸钠粉末溶解于lOOml摩尔浓度分别为0．1359和 0．1M的氯化钠、磷酸氢二钾混合水溶液中，配置成浓度为1％(w／v)的 水溶液。将高温高压灭菌后的备用．(2)分别将0．59、0．759、1．Og、◆1．259SeaPrel毋琼脂糖粉末溶液于IOOmlPBS液中，制成浓度为O．5％、0．75％、1．096、1．25％(v／v)的水溶液，采用0．22Ilm一次性滤器除菌后 备用．(3)在超净台内，从孵育9一lO天后的受精伊莎褐鸡蛋中取出鸡 胚，并在解剖显微镜下，摘取鸡胚背根神经节(DRG)组织块，将其至于 D一№nk’s液中．(4)分组将1％(w／v)藻酸纳及0．5％、0．75％、1．o％、 1．25％(w／v)SeaPrep固琼脂糖水溶液加入48孔培养板中，每孔200Il 1。 (5)将摘取的鸡胚DRG组织块接种于48孔培养板中，每孔3-4枚．(6) 将10％葡萄糖酸钙注射液缓慢滴入加有1％(w／v)藻酸纳水溶液的培养孔 中，使ca”终浓度为20ram。形成藻酸钙水凝胶后，吸取多余的葡萄糖酸 钙溶液。(7)将加有seaPre庐琼脂糖水溶液的培养板放入4℃冰箱中 10-15分钟结胶。(8)在每个培养孔凝胶顶部加入500 Il l DMEM／F12 培养基(其中含有10％胎牛血清，1％青霉素／链霉素)(9)将培养板置 于37℃，95％湿度，5％C0,的孵箱中培养。(10)使用倒置相差显微镜，-对鸡胚DRG组织块在藻酸钙及琼脂糖水凝胶中三维培养24小时、2天、●4天后的生长情况进行连续观察。培养4天后，从每个三维生长背根节州川大学临床医学七年制学位论文李夏组织块中，选取8根生长最好的轴突进行拍照，以测量其长度．分组记 录所得数据，并采用SPSS 13．0统计软件对数据进行方差分析和SNK(q) 检验．结果 形态学观察结果： (1)培养24小时后，固定于1％(霄／v)藻 酸钙水凝胶之中的鸡胚DRG组织块周围出现一宽约0．10-0．15mm环行半 透明区域，该区域随着培养时间的延长而逐渐扩大，其中可见少量游走 细胞。提示藻酸钙水凝胶已部分被降解。轴突从DRG组织块周边逐渐放 射状长出，穿过该半透明区域，伸向藻酸钙凝胶中．培养4天后，轴突 的平均长度为213+／-35／Ⅱm． (2)种植于0．5％(霄／v)SeaPrep@琼脂糖 凝胶中的DRG组织块，于培养24小时后即呈现典型的二维贴壁生长模 式． (3)接种于0．75％、1．o％、1．25％(w／v)SeaPrep@琼脂糖凝胶中的DRG组织块均生长良好，可见密集成簇的轴突从组织块向四周放射状发出．培养4天后，轴突长度分别为533+／-90／Mm(O．75％)，762+／-5砸m (1％)，344+／-63／[‘m(1．25％)．统计学分析示，轴突在1％(w／v)藻酸钙 凝胶中的生长明显滞后于0．75％、1．0％，1．25％(w／v)SeaPrep。琼脂糖 凝胶．(pO．05)另外，1．096(w／v)SeaPre妒琼脂糖凝胶较0．75％及1．25％ (w／v)的琼脂糖凝胶能适合体外鸡胚DRG轴突的三维生长．(pO．05) 结论本试验证实了体外鸡胚DRG组织块在1％(w／v)藻酸钙和0．75％、 1．0％、1．25％(w／v)琼脂糖水凝胶基质材料中均能够存活，轴突呈三维 方式生长．鸡胚DRG神经轴突需通过1％(w／v)藻酸盐凝胶部分降解后 形成的间隙向外延伸，较其它天然基质材料有所不同．在体外环境中， 相对缺少降解藻酸钙凝胶所需的细胞成分，导致凝胶降解较体内缓慢， 可能是轴突在藻酸钙凝胶中生长明显滞后于琼脂糖凝胶的原因．另外， 接种于0．5％(w／v)的SeaPre妒琼脂糖水凝胶中的DRG组织块呈现典型 的二维贴壁生长模式，提示该浓度琼脂糖水凝胶可能由