磺胺类药物多残留ELISA快速检测试剂盒与胶体金免疫层析试纸条的初探-预防兽医学专业论文.docxVIP

磺胺类药物多残留 ELISA 快速检测试剂盒与胶体金免疫层析试 纸条的初探 摘 要 实验中采用 4-氨基苯甲酸甲酯(PBPA)和对乙酰氨基苯磺酰氯(ASC)为原料，经过亲和取代， 酯的水解反应合成磺胺药物共有的母核结构苯甲酸对氨基苯磺酰胺(SH)，应用质谱法(ESI-MS)与 核磁共振氢谱法(1H-NMR)鉴定 SH。质谱结果显示[M-]=291.03766，与理论值[M]=292 相符，表 明 SH 合成成功；核 磁 共 振 氢 谱(1H-NMR)的数据与 SH 化合物的结构相符。磺胺母核人工半抗 原合成成功。 实验采用混合酸酐法将本实验室合成的磺 胺 类药物母核结构物(SH)与卵清蛋白(OVA)和牛 血清白蛋白（BSA）相偶联，进而合 成包被原 OVA-SH 和免 疫原 BSA-SH。紫外扫描(UV)与 SDS法进行确证。利用 BSA-SH 免 疫 Balb/C 小鼠，间接 ELISA 和间接竞争 ELISA 法筛 选细胞融合备用鼠；利用细胞融合杂交瘤技术建立了 SH Mab 细胞株，后体内诱生腹水法制备 SH Mab。对 SH Mab 的效价、特 异 性和敏 感 性 等 免 疫 学 特 性 进 行 鉴 定。结果显示 BSA-SH 人工 抗原合成成功，SH 与 BSA 的分子结合比约为 11.6：1。5G1、5G2 和 8D2 3 株敏感特异性的杂 交 瘤 细 胞 株 被 成 功 筛 选。其细胞上 清 液 效 价 分别为：1：6.40×102、1：1.28×103 和 1：3.20×102， 腹 水 效 价 分别为：1：2.56×105、1：5.12×105 和 1：1.28×105。5G2 株所产腹水纯化后所得 Mab 对 SH 的半数 抑 制 浓 度(IC50)为 82ng/mL。纯化后 Mab 对 磺 胺 间 甲 氧 嘧 啶（SMM）、磺 胺 对 甲 氧 嘧 啶（SMD）、磺 胺 甲 基 嘧 啶（SM）、磺 胺 间 二 甲 氧嘧 啶（SDM）、磺 胺 醋 酰 （SCT）、磺 胺 氯 吡 嗪 钠（SCZ）、磺 胺 噻 唑（ST）、磺 胺 甲 噁 唑（SMZ）、磺 胺 苯 吡 唑（SPH）、磺 胺 二 甲 嘧 啶（SM2）、氨 苯 磺 胺（SSF）和 磺 胺 喹 噁 （SQ）的交 叉 反 应 率 分 别为：108%、86% 105%、85.6%、72% 、26%、32%、54.6%、43%、4.6%、0.5%和 76%。 获得了抗磺胺母核 SH 高效价、敏感、特异的 Mab。 实验将卵清白蛋白（OVA）与磺胺母核人工半抗原（SH）采用混合酸酐法，按投料比 1:2 连接制备了包被原（SH-OVA），后将辣根过氧化物酶（HRP）与 SH-OVA 采用过碘酸钠法，按 投料比 2：1 连接制备了酶标抗原（SH-OVA-HRP）。直接竞争 ELISA 方法通过药物竞争试验被 确定，在 0-1000 ng/mL 浓度范围直接竞争 ELISA 建立标准曲线方程程为：y=-0.4016x+1.2187， 相关系数 R2=0.97，半数抑制浓度(IC50)为 61.60ng/mL。SH 酶联免疫检测试剂盒雏形初步研制成 功。每 2 个月随机抽检其稳定性，4 个月后稳定性良好。 利用得到的 Mab 研制出了检测磺胺类药物多残留胶体金免疫层析试纸条雏形。试纸条用间接 竞争法，选用 20 nm 的胶体金，在 pH 7.8，单抗 17 μg/mL 条件下制备金标抗体。检测线为 SH-OVA， 质控线用羊抗鼠 IgM 抗体，两条线都包被在硝酸纤维素膜上。随后对试纸条的使用材料、溶液和 各种工艺进行了优化。 关键词：磺胺类药物；多残留；半抗原；单克隆抗体；ELISA 试剂盒；胶体金试纸条；检测 I PAGE PAGE VI III III Development of ELISA Mehods and Kits for Rapid Detection and an Colloidal Gold Immunochromategraphic Srip for Detection of Sulfonamides Abstract 4-aminobenzoate (PBPA) acetylamino-benzenesulfonyl chloride(ASC) as raw material, after nucleophilic substitution, ester hydrolysis reaction synthetic sulfa drugs mother nucleus structure benzoic aminobenzene sulfonamide (SH), he application of mass spectro