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分子生物学实验技术;分子生物学研究;Contents;2011级硕士生分子生物学实验;2011级硕士研究生分子生物学实验课程表;核酸的分离与纯化;真核核酸提取的主要步骤;Step 1;真核基因组DNA的制备与分析 ; 制备基因组DNA是进行基因结构和功能研究的重要步骤。可从新鲜组织、培养细胞或低温保存的组织细胞中提取。常采用EDTA、SDS以及蛋白酶K等试剂作用下破膜、消化细胞，并使组织蛋白与DNA分子分离，再用酚、氯仿/异戊醇抽提去除蛋白质，最后经乙醇沉淀而获得高纯DNA。操作中常加入RNase除去RNA，这一方法获得的DNA可用于Southern分析，还可用于PCR的模板、基因组DNA文库构建等实验。通常可得到100～200kb的DNA片段。（一般真核细胞基因组DNA有107-9bp。） DNA提取应注意 （1）防止和抑制DNase对DNA的降解； （2）尽量减少对溶液中DNA的机械剪切破坏。;操作步骤 ;2．室温下加500μl饱和酚至样品处理液中，缓慢颠倒混匀10min。 3．离心12000rpm×10min,取上层水相到新Ep管中 (约450μl)。 4．加等体积氯仿/异戊醇（24：1），充分混匀，离心12000rpm×10min，取上层水相(约300μl)到另一Ep管中。 5．加1/10体积的3 mol/L 醋酸钠(pH5.2)和2.5倍体积预冷的无水乙醇，颠倒混匀。 6．离心14000rpm×15min，小心弃上清液。 7．沉淀用70%冷乙醇洗涤1-2次，离心收集沉淀DNA,室温下挥发乙醇(勿使DNA完全干燥)。 8．沉淀DNA加50-100μl TE缓冲液溶解，－20℃保存或直接分析.;标本必须新鲜，提取前细胞应保持完整。所用Ep管、滴头等用品及ddH2O、试剂等应高压灭菌，操作尽量在4℃以下进行。 混匀试剂、吸取上清液等操作时应避免动作剧烈。 弃去乙醇时动作应轻，切忌甩干，以免DNA丢失。 37%以上浓度的异丙醇或者70%以上浓度的乙醇可选择性沉淀DNA，一般不需在低温条件下长时间放置。其缺点是易使盐类与DNA共沉淀；所以常规需要70%乙醇漂洗DNA沉淀物。 室温下放置16h或65℃放置1h，可加快基因组DNA沉淀的溶解。;核酸的鉴定与分析 ;DNA的鉴定;操 作;核酸凝胶电泳－核酸的分级分离; 影响核酸电泳的因素 ;核酸电泳的指示剂与染色剂;琼脂糖凝胶电泳;二、DNA的琼脂糖凝胶电泳 ;【操作步骤】;【注意事项】;;真核细胞RNA的制备与分析 ;抑制RNase活性是提取RNA的关键 实验中严格控制内源性和外源性RNase的污染。RNase可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌等。 外源性RNase存在于操作人员的手汗、唾液等，也可存在于灰尘中。在其它分子生物学实验中使用的RNase也会造成污染。这些外源性的RNase可污染器械、玻璃制品、塑料制品、电泳槽、研究人员的手及各种试剂。 各种组织和细胞中则含有大量内源性的RNase。 ;玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6hr或更长时间。 塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿冲洗（注意：有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀，故不能使用）。 有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3% H2O2 室温10min，然后用0.1% DEPC水冲洗，晾干。 配制的溶液应尽可能用0.1% DEPC，在37℃处理12hr以上，然后用高压法除去DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22μm滤膜过滤除菌。 操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，实验中手套要勤换。 设置RNA操作专用实验室，所有器械等应为专用。;焦磷酸二乙酯（DEPC）：是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。高温条件下分解。 异硫氰酸胍：目前被认为是最有效的RNA酶抑制剂，它在裂解组织的同时也使RNA酶失活。它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来，又对RNA酶有强烈的变性作用。 氧钒核糖核苷复合物：由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和RNA酶结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制RNA酶的活性。 RNA酶的蛋白抑制剂（RNasin）：从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂，可以和多种RNA酶结合，使其失活。 其它：SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用。 ;RNA的分离和纯化- TRIzol试剂法;取150-200mg鼠肝组织置匀浆器中，加2ml Trizol冰上匀浆，将匀浆液1ml 转至Ep管中，静置５min。 加入0.3ml氯仿，振荡15s，静置2min。 4℃离心，12000rpm×15min，取