血液学检验实验指导.doc

血液学检验实验指导 实验一、活化凝血时间测定 【实验原理】 同试管法CT测定。试验中加入白陶土-脑磷脂的悬液以充分激活因子Ⅻ和Ⅺ，并为凝血反应提供丰富的催化表面，故称为活化凝血时间（ACT）；还可以避免因接触激活阶段的不同结果带来的影响，从而提高了本试验的敏感性和重复性。 【试剂】 1．脑磷脂的制备 脑磷脂是将兔脑粉中的组织凝血活酶除去参与外源凝血途径的蛋白部分后所得的磷脂，故又称部分凝血活酶。取干燥兔脑粉1.2g加25ml丙酮，放置2h后过滤，将此兔脑粉加氯仿25ml，连续震荡2h，以滤纸过滤，滤液蒸发后为淡黄色蜡状物，刮入玻璃研钵中，加12ml生理盐水研磨成均匀乳剂，以每安瓶0.25ml 2．4%白掏土悬液 白陶土2g加入50ml 3．4%白陶土-脑磷脂悬液 将脑磷脂用巴比妥缓冲液作1：50稀释后，再加等量4%白陶土悬液混合而成。4οC可保存3天，用时充分混合。 4．巴比妥缓冲液 巴比妥钠11.75g、NaCl14.67g、0.1mol/L的HCl430ml，加蒸馏水至2000ml。此缓冲液pH应为7.3 【操作方法】 1．在含4%白陶土-脑磷脂悬液0.2ml的试管中注入受检全血0.5，轻轻混匀。 2．其余操作同试管法CT测定。 【参考值】 1.70±0.76 (1.14～2.05)min。 【临床意义】 1．同试管法CT测定，但较其敏感，重复性也较好，可检出因子Ⅷ：C小于45%的亚临床型血友病。 2．是监测体外循环肝素用量的良好指标之一。 实验二、血浆游离血红蛋白测定（邻一甲联苯胺法） 【实验原理】 邻一甲联苯胺在酸性溶液中和过氧化氢与血红蛋白共同作用生成氧化型联苯胺，产生绿色→蓝色→紫色，其颜色的深浅与血浆游离血红蛋白的含量呈正相关。 【试剂】 1．2g/L邻一甲联苯胺溶液 称取邻一甲联苯胺0.2g，溶于冰醋酸60ml，加蒸馏水至100ml, 2．1%过氧化氢溶液 用30%过氧化氢原液新鲜配制。 3．10%冰醋酸溶液。取10ml冰醋酸，加蒸馏水至100ml。 4．血红蛋白应用标准液 将血红蛋白贮存液用生理盐水稀释成10mg/100ml 备用。 5．抗凝试管 取0.2ml 100U/ml肝素于试管内，在80℃以下烘干，每管可抗凝2ml 【操作方法】 1．将抗凝全血分离血浆。 2．取试管3支，分别标明测定、标准和空白，分别加入血浆、应用标准液，再向 各管中分别加入邻一甲联苯胺溶液及1%过氧化氢溶液各1.0ml，充分混匀，放置10min。 3．于上述3支试管内分别加入10%冰醋酸溶液10ml混匀，用435nm波长比色，以空白调“0”，读各管吸光度。 4．计算： 测定管吸光度 游离Hb( mg/L) = ________________________ ×100 标准管吸光度 【质量控制】 1. 一切容器均应避免血红蛋白污染，标本勿溶血，否则可引起假阳性。 2. 过氧化氢溶液浓度要准，新鲜配制。 3. 联苯胺醋酸的含水量不能低于15%和超过30%，否则均可引起吸光度降低。 4. 标准液的加入量一定要准。 【参考区间】 40mg/L 【临床意义】 血浆游离血红蛋白含量增加是血管内溶血的特征。血浆中血红蛋白含量超过与血清中结合珠蛋白的结合能力时，其含量即可升高。微血管内溶血时，血浆游离血红蛋白含量均明显升高。PNH为200～2500mg/L，输不合血型后为150～5000mg/L。温抗体型自身免疫性溶血性贫血、镰状细胞贫血及地中海贫血时血浆游离血红蛋白可轻度或中度增加。血管外溶血则正常。 实验三、血清结合珠蛋白测定（比色法） 【实验原理】 血清结合珠蛋白（Hp）是肝脏产生的a2糖蛋白，它与游离的血红蛋白（Hb）具有特殊的亲合力，可形成稳定的Hb-Hp复合物，后者在弱酸性（pH4）条件下，具有过氧化物酶的活性，测其活性可间接反映Hp的含量。 【试剂】 1．乙酸缓冲液0.2mol/L（pH4） 称取乙酸钠（NaAC·3H2O）2.8g,冰乙酸5.7ml溶解，加蒸馏水至500ml。 2．0.1%（V/V）愈创木酚溶液 取1ml愈创木酚溶液于500ml乙酸缓冲液中，加蒸馏水至1000ml。 3．0.3%过氧化氢溶液 临用前配制。 4．0.5g/L 高铁血红蛋白液。 【操作方法】 1．取静脉血分离血清，避免溶血。 2．取受检血清0.4ml，与等量高铁Hb 溶液混合。 3．取上述混合液0.2ml，加入于已预温（25℃）的愈创木酚5ml溶液中，再加入0.5ml 0.3%过氧化氢，于25℃水浴内作用8 4．用蒸馏水调“0