鸡胚胎性疫病病原检测和禽波氏杆菌OMPA原核表达及免疫原性检测-预防兽医学专业论文.docxVIP

山东农业大学硕士学位论文 山东农业大学硕士学位论文 鸡胚病原菌检测和禽波氏杆菌外膜蛋白 鸡胚病原菌检测和禽波氏杆菌外膜蛋白 A 原核表达及免疫原性检测 PAGE PAGE 1 PAGE PAGE 2 中文摘要 禽波氏杆菌病是由禽波氏杆菌引起的一种禽的高度接触性传染病，由于该菌既能水 平传播又能垂直传播，所以在家禽传代过程中，该病不断得以放大，给家禽造成更大的 危害。本研究对山东省某三个大型肉种鸡场的 764 枚死亡鸡胚进行病毒性及细菌性的病 原检测。采用核酸探针技术及 ALV-p27 检测试剂盒方法对几种主要病毒进行检测，结 合传统的细菌检测方法和 23S rRNA 基因克隆测序的方法检测几种主要病原菌。从而确 定死亡鸡胚中病毒与病原菌的多重感染情况。发现由禽波氏杆菌感染引起的鸡胚死亡占 有较大的比重，约占 23.56%。 近年来禽波氏杆菌病的广泛存在已给养禽业带来较大的经济损失。目前没有特效疫 苗，致使该病得不到合理有效的防治。本研究对实验室已有的禽波氏杆菌进行 23S rRNA 基因克隆测序，确定其与从死亡鸡胚中的新分离株（LL、XT 株）的同源性为 99.2%～ 99.7%。对新分离株（LL 株）的外膜蛋白 A（OMPA）进行克隆测序，确定其与 AM167904 株禽波氏杆菌的核苷酸序列同源性为 77.1%，氨基酸序列同源性为 83.2%。将 OMPA 进 行原核表达，纯化后的蛋白免疫 4 周龄 Babl/c 小鼠并检测抗体效价。为筛选禽波氏杆菌 外膜蛋白中的有效免疫成分用于研制禽波氏杆菌外膜蛋白亚单位疫苗具有重要意义。 第一部分 规模化肉种鸡场胚胎性疾病的多重感染及鸡胚病原菌多重 PCR 检测方法的建立 对山东某三个大型肉种鸡场 17~19 日龄的死亡鸡胚进行细菌分离鉴定，经形态特性、 生化特性、血清学试验及 23S rRNA 测序分析，分析确定细菌种属，并统计不同病原菌 之间的多重感染比率，经核酸探针技术及 ALV-p27 检测试剂盒进行 ALV、REV 和 CIAV 的检测并对其之间的多重感染比率进行统计。发现导致鸡胚死亡的病原菌主要为禽波氏 杆菌（23.56%），大肠杆菌(46.47%)，沙门氏菌(56.28%)，绿脓杆菌(45.18%)，葡萄球 菌(15.71%)，且相互之间的二重感染、三重感染、四重感染的合计比率分别为 35.34%、 26.18%、0.65%。禽波氏杆菌与其他病原菌间的二重感染、三重感染、四重感染比率分 别达到 7.84%、13.08%和 6.54%。导致鸡胚死亡的主要病毒因素 ALV、REV 和 CIAV 的 感染比率分别为 13.00%、20.00%和 23.00%，其二重感染、三重感染的比率合计分别为 11.00%和 2.00%，禽波氏杆菌与这三种病毒间的二重感染、三重感染和四重感染比率分 别为 15.00%、6.00%和 1.00%。根据禽波氏杆菌的 OMPA 基因、沙门氏菌 invA 基因、 大肠杆菌 phoA 基因和绿脓杆菌 toxR 基因序列各设计了 1 对特异性引物，用于这几种主 要病原菌的多重 PCR 方法的快速准确检测。为相关病原菌的快速检测提供了有效依据。 第二部分 禽波氏杆菌分离株的 23S rRNA 进化分析 对已有的波氏杆菌进行 23S r RNA 基因的测序分析，发现以前保存的 8 株禽波氏杆 菌与新分离株（LL、XT 株）之间核苷酸序列同源性为 99.2%~99.7%，与 GenBank 中收 录的 NC_010645 株禽波氏杆菌核苷酸序列同源性为 92.4% ~92.5%，与兔支气管败血波 氏杆菌和猪支气管败血波氏杆菌的核苷酸序列同源性均为 98.5% ~ 99.2%。国内分离的 禽波氏杆菌菌株和支气管败血波氏杆菌菌株均与国外分离菌株在遗传基因上有一定的 差异，并且 23S rRNA 序列分析可以作为鉴定禽波氏杆菌的一种快速简便的方法。 第三部分 禽波氏杆菌外膜蛋白 A (OMPA)免疫原性检测 对禽波氏杆菌（LL 株）的外膜蛋白 OMPA 基因进行 PCR 扩增、克隆及序列测定。 禽波氏杆菌 OMPA 基因全长 597 bp，编码 199 个氨基酸。将禽波氏杆菌 OMPA 基因片 段克隆到 PGEX 4T-3 表达载体中，转化至 E.coli BL21(DE3) 感受态进行诱导表达，将 纯化的蛋白免疫 4 周龄 Babl/c 小鼠并检测抗体效价。以纯化的重组蛋白 OMPA 包板， 检测抗体效价最高为 5.4，并不能起到免疫保护作用。这一结论为进一步筛选禽波氏杆 菌外膜蛋白亚单位疫苗提供了参考依据。 关键词：胚胎性疾病；禽波氏杆菌；23SrRNA；OMPA；免疫原性 Abstract Bordetalla avium has been s