黄喉拟水龟CCL20基因序列特征及表达分析-水产养殖专业论文.docxVIP

2 2 上海海洋大学硕士学位论文 答辩委员会成员名单 姓名 工作单位 职称 备注 李桂峰 中山大学 教授 主席 罗建仁 珠江水产研究所 研究员 委员 卢迈新 珠江水产研究所 研究员 委员 陈昆慈 珠江水产研究所 研究员 委员 赵建 珠江水产研究所 助理研究员 秘书 答辩地点： 中国水产科学研究 院珠江水产研究所 答辩日期： 2012.5.25 I I 黄喉拟水龟 CCL20 基因序列特征及表达分析 摘 要 利用本实验室构建的黄喉拟水龟 SMART 全长 cDNA 文库，筛选得到巨噬 细胞炎症蛋白-3α（MaMIP-3α 或 MaCCL20）全长 cDNA 序列，Maccl20 基因 cDNA 全长 2318 bp，5’非编码区（Untranslated region, UTR）长 1525 bp，3’UTR 长 532 bp，开放阅读框（Open reading frame, ORF）为 261 bp，编码 86 个氨基酸组成的 多肽链，分子量为 9.739 kDa，理论等电点为 9.004。综合亲水性表面可及性以及 抗原指数三项指标，预测可形成抗原表位的氨基酸区域数为 7。同源性分析表明， 黄喉拟水龟与变色蜥（Anolis carolinensis）、原鸡（Gallus gallus）的巨噬细胞炎 症蛋白-3α 亲缘关系最近。荧光定量 PCR 结果显示：MaMIP-3α 在肝脏、肾脏、 心脏、脾脏中均有表达，脾脏中表达量最高。 根据黄喉拟水龟巨噬细胞炎症蛋白-3α（Mauremys mutica Cantor Macrophage inflammatory protein 3α，MaMIP-3α 或 MaCCL20）的 cDNA 全长设计特异性引物， 然后采用 PCR 克隆技术从黄喉拟水龟的肝脏组织中克隆出 MaMIP-3α 的成熟肽的 基因序列。将得到的成熟肽序列插入到 PMD18-T 克隆载体上，转化进大肠杆菌 E.coli DH5α 中，得到的质粒经 PCR 以及测序鉴定正确后，将双酶切目的片段插 入到表达载体 pET-32a 上，构建成原核表达重组质粒 pET-32a-CCL20 并将表达质 粒转化入大肠杆菌 BL21 中，经 IPTG 诱导后成功表达出了 pET-32a-CCL20 融合 蛋白。以该融合蛋白为抗原制备了多克隆抗体。经过测序分析表明，MaCCL20 的成熟太基因序列成功的插入到表达载体 Pet-32a 中。经过 IPTG 诱导表达、 SDS凝胶电泳和 Western bolt 分析显示，所表达的融合蛋白的相对分子质 量约为 30KD，与目的蛋白大小一致并且与带 His 标签的单克隆抗体发生特异性 反应。经 His Bind 镍柱纯化后 SDS凝胶电泳检测出现单一条带。实验结 果表明成功的获得了黄喉拟水龟 MaCCL20 的多克隆抗体。为建立检测黄喉拟水 II II 龟内源性 MaCCL20 的免疫检测法、酶联免疫吸附法、放射性免疫法等奠定了基 础，为后续探索巨噬细胞炎症蛋白-3α 在黄喉拟水龟的非特异性免疫反应中作用 提供了一些重要的信息。 关键词：黄喉拟水龟，巨噬细胞炎症蛋白-3α，序列特征，组织表达，重组表达， Western blot PAGE PAGE IV Study On Gene Sequence Characteristics And Expression Of CCL20 In Mauremys mutica ABSTRACT Mauremys mutica SMART full-length cDNA library constructed in our lab, and screening of macrophage inflammatory protein-3α (MaMIP-3α or MaCCL20 for) full-length cDNA sequence, Maccl20, full-length cDNA of 2318 bp in the 5 non-coding District (Untranslated region, UTR) of length 1 549 bp, 3UTR length 475 bp open reading frame ORF) (Open reading frame of 261 bp, and encodes 86 amino acids of the polypeptide chain, the molecular weight of 9.739 kDa., theoretical isoelectric point is 9.004. Integrated hydrophilic surface antigen i