教学试验室医学真菌的保藏.DOC

教学实验室医学真菌的保藏 ??????? 【关键词】? 真菌 保藏 实验室 微生物学??? 医学真菌作为自然界重要的生物资源,已成为微生物学实验中不可或缺的基本材料,应用频率较高。这其中部分为病原性真菌,而如何有效地保存保管好真菌菌种,以何种方式长期稳定地保持其生物遗传特性,则成为我们日常工作中需要研究探讨的问题。??? 1???? 材料与方法??? 1.?? 1???? 教学实验室保存的菌种???? (1)单细胞真菌:白色念珠菌、新生隐球菌。(2)多细胞真菌:黑曲霉菌、青霉菌、木霉菌。??? 1.?? 2???? 医学真菌菌种的鉴定???? 菌种使用前,均需进行形态学、生化学方面的鉴定,合格后方可使用。具体鉴定方法:(1)单细胞真菌:碳源发酵试验、产子囊孢子及芽管试验、咖啡酸试验、尿素酶试验;单细胞与多细胞真菌鉴定共用实验:玉米粉吐温80琼脂小培养显微镜下观察。(2)多细胞真菌:蛋白水解试验、37℃生长试验、温度试验、PDA小培养实验。??? 1.?? 3???? 真菌菌种的保藏方法???? 由于教学实验各时期使用的真菌菌种在数量及种类上不尽相同,所以与其相适应的培养方法与保管方式亦不相同。大体上分为定期传代保存法、超低温冻结保存法两种。??? 1.?? 3.?? 1???? 定期传代保存法???? (1)液体培养基保存法:单细胞真菌接种于RPMI 1640培养基中,37℃培养24 h,取出后置4℃冰箱保存。该方法用于学期初低温冻结菌种的复苏、增菌培养。(2)琼脂平板培养基保存法:学期开始,多细胞冻结菌种解冻后,划线接种于察氏平板培养基上面,28℃培养7~8? d,再将培养菌络移种于改良马丁平板培养基上,28℃培养7 d,待培养菌络生长良好,置4℃冰箱保存。为多细胞真菌的复苏与鉴定试验。(3)琼脂斜面培养基保存法:单细胞真菌由液体培养基中多细胞真菌从马丁培养基表面,分别挑取菌种菌络,蜿蜒化线接种于各自相对应的琼脂斜面培养基中,经37℃或28℃培养生长良好后,置4℃冰箱保存备用。该方法用于学期中,真菌菌种即将使用,实验课前的菌种纯化和制备阶段。(4)液体石蜡覆盖保存法:将无菌液体石蜡油覆盖于菌络生长良好的琼脂斜面真菌培养物表面,厚度约1 cm左右,置4℃冰箱保存。该法用于学期末对真菌菌种较长时期的保存方法。??? 1.?? 3.?? 2???? 液氮超低温冻结保存法???? 将单细胞或多细胞真菌培养物,以无菌生理盐水洗下并计数,加入等量脱脂牛奶保护剂,分装进安瓿后封口。选择菌种不同的适宜冷却速度,使瓿内菌悬液急速或慢速冻结成冰。置液氮超低温下保存。??? 2???? 结果??? 2.?? 1???? 定期传代保存法???? (1)液体培养基保存法,可保存单细胞真菌15 d左右。(2)琼脂平板培养基保存法,保存多细胞真菌15 d。(3)琼脂斜面培养基保存法,保存单细胞、多细胞真菌1个月。(4)液体石蜡覆盖保存法,可保存真菌菌种6个月。??? 2.?? 2???? 液氮超低温冻结保存法???? 可保存冻结菌种1年。??? 3???? 小结??? 一般认为,传代移种保存法保存的菌种,易失去病原性,而超低温保存法能够完整的保存菌种的致病性[1]。为此,我们针对实验的初、中、末3个时期,对菌种的保存选择不同的保存方法,优化了菌种的遗传特性不变性[23]。??? 实验显示,反复的移种传代会使菌种的致病力和生理活性下降,孢子形成能力减弱,故超低温冻结保存菌种,是最佳保藏菌种的方法,唯一不足的是菌种复苏启动时间较长。??? 【参考文献】??? [1]王家俊.临床真菌检验[M].上海:上海医科大学出版社,1995:312.??? [2]张卓然.医学微生物实验学[M].2版.北京:科学出版社,2002:228229.??? [3]王 英.医学微生物实验室菌种的保存和保管[J].海南医学院学报,2006,12(1):57.