用淋巴细胞分离液分离单个核细胞1分离外周血中的单个.pdf

中国试剂网 3.8.8.192 用淋巴细胞分离液分离单个核细胞 1）分离外周血中的单个核细胞 （PBMC ） 1．抽取正常人静脉血加到肝素抗凝管中，加等量含5～10IU/ml 肝素的无血清缓 冲液悬浮细胞。将细胞悬液小心加在与血液等量的淋巴细胞分离液上，室温中， 水平离心500 ×g 20 分钟。此时离心管中形成5 层：最上面是血浆，血浆层和淋 巴细胞分离液之间是PBMC ，淋巴细胞分离液层和最下面的红细胞层之间是粒细 胞层，又成为棕黃层。 2 ．吸去最上层的血浆，收集血浆层和淋巴细胞分离液交界面的单个核细胞，尽 量全部吸出PBMC 。加1～2 倍量含5IU/ml 肝素、2 ％灭活小牛血清的Hanks 液 （洗涤液），混匀后离心200 ×g 10 分钟，低速离心有利于去除细胞悬液中留存 的血小板，去上清液。 3 ．再用同样洗涤液洗涤细胞2 次，每次离心500 ×g 10 分钟，洗去残留的淋巴 细胞分离液。用 1％台盼蓝染色检测细胞活力 （应95 ％）并计数细胞。再用含 10％小牛血清的细胞培养液将细胞配成适当浓度。通常，每毫升外周血可得1× 106～2 ×106PBMC。 2 ）分离关节滑液中的单个核细胞 1．将关节滑液置含肝素 （终浓度5IU/ml ）的离心管中，离心1000×g 15 分钟。 2 ．用含2 ％灭活小牛血清的Hanks 液悬浮沉淀细胞并洗涤细胞 1 次，每次离心 1000×g 15 分钟。用含2 ％灭活小牛血清的Hanks 液悬浮细胞至原容量。 3 ．用淋巴细胞分离液分离关节滑液中的单个核细胞，并用含10％小牛血清的细 胞培养液将细胞配成适当浓度。 3 ）分离组织中的单个核细胞 1．取外科分离的各种组织，用含1％庆大霉素和1％小牛血清的MEM 培养液洗 涤组织块，洗去可能的污染物。将组织块置培养皿中，加入约为组织块体积5～ 10 倍的同样MEM 培养液。用无菌外科剪刀将组织块剪碎成0.5mm3 大小。 2 ．将组织块转移到小培养瓶中，静置片刻，吸去培养液。加入约2 倍组织块体 积的、滤过除菌的酶溶液。37℃水浴摇床中消化1～2 小时，注意组织块的消化 中国试剂网 3.8.8.192 程度。 3 ．当组织块消化分散后，用手用力摇晃培养瓶3～5 分钟或用大口吸管反复吹打， 使细胞团进一步分散。加入30ml 上述MEM 培养液，终止酶反应。 4 ．让上述悬液通过200 目的金属网或尼龙网，分离单个细胞。用上述MEM 培 养液洗涤细胞3 次，每次离心1000×g 10 分钟。用1％台盼蓝染色法检测细胞活 力并计数细胞。 5 ．如果细胞量较多（107 ），应当用上述淋巴细胞分离液分离出单个核细胞，并 用含10％小牛血清的细胞培养液将细胞配成适当浓度。 4 ）从小鼠胸腺中分离胸腺细胞 1．脱臼或剪头处死小鼠，置75 ％乙醇中浸泡消毒。腹面向上固定，剪开小鼠胸 腔，暴露和摘取胸腺。在平皿中用Hanks 液洗净血液，去除结缔组织。 2 ．在有少量细胞培养液的平皿中，用镊子梳理胸腺，再用大口吸管反复吹打， 分离单个细胞。离心沉淀细胞，用细胞培养液洗涤细胞1 次。加入适量细胞培养 液，静置5 分钟，让大的组织块自然沉降，吸出单个胸腺细胞。 3 ．用1％台盼蓝染色法检测细胞活力，计数细胞。再用含10％小牛血清的细胞 培养液将细胞配成适当浓度。