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Real-time qPCR 手册 手把手教你从菜鸟到高手 Real-time qPCR 手册手把手教你从菜鸟到高手 目录 前言……………………………………………………………….….………... 3 一、Real-time qPCR 发展史………………………………………..…….…..3 二、Real-time qPCR 概述………………………………………….…………3 三、Real-time qPCR 实验设计………………………………………………8 四、Real-time qPCR 操作过程…………………………………………….…9 五、Real-time qPCR 数据分析…………………………………………...…16 六、Real-time qPCR 常见问题分析…………………………..……….……19 Real-time qPCR 手册手把手教你从菜鸟到高手 Real-time qPCR 手册手把手教你从菜鸟到高手 前言 由于 Real-time qPCR 的众多优点，现在已经是生命科学领域的一项常规技 术。越来越多的研究文章中涉及 RT-PCR 的实验，也基本上被 real-time qPCR 所代替。由于 real-time aPCR 输出的数据不同于常规的 PCR 电泳检测，很多没 有做过 real-time qPCR 的研究者常常感到高深莫测，不知从何入手；甚至一些 做过次实验的研究者也会对数据处理分析感到迷惑，不知所措。本文就从 real-time qPCR 的发展史说起，包括 real-time qPCR 的原理，实验设计，实际 操作（以 ABI StepOne 仪器，和北京百泰克生物技术有限公司的试剂为例），数 据分析，常见问题解答五个方面，手把手教你从各个方面了解 real-time qPCR， 彻底的从菜鸟到高手！ 一、Real-time qPCR 发展史 Real-time qPCR 就是在 PCR 扩增过程中，通过荧光信号，对 PCR 进程进行 实时检测。由于在 PCR 扩增的指数时期，模板的 Ct 值和该模板的起始拷贝数存 在线性关系，所以成为定量的依据。由于常规的 PCR 的缺点，real-time qPCR 由 于其操作简便，灵敏度高，重复性好等优点发展非常迅速。设在已经涉及到生命 科学研究的各个领域，比如基因的差异表达分析，SNP 检测，等位基因的检测， 药物开发，临床诊断，转基因研究等。 在 Real-time qPCR 技术的发展过程中，定量 PCR 仪的发展起了至关重要的 作用。1995 年，美国 PE 公司（已经并入 Invitrogen 公司）成功研制了 Taqman® 技术，1996 年推出了首台荧光定量 PCR 检测系统，通过检测每个循环的荧光强 度，通过 Ct 值进行数据分析。从而荧光定量 PCR 获得广泛应用。现在的定量 PCR 仪有 ABI 7000、7300、7500，7700、7900HT、StepOnePlus TM、StepOne TM、 PRISM® StepOne TM 系列；BIO-RAD 的 CFX96、iCycler iQ5®、MyiQ®、MJ Research Chromo4 TM Opticon 系列；Stratagene Mx TM 系列；Roche LightCycler®系列； Eppendorf Masercycler®；Corbett Rotor-Gene TM；Cepheid SmartCycler® 和 BIOER 的 LineGene 系列（考虑到其是日资子公司，还是不并入国内企业吧！）。 随国内生命科学的快速发展，科研水平不断提高，发高水平文章已不再是新 鲜事。与其同时，国内公司经过长期不懈的努力，也有自主研发的 real-time PCR 仪器生产比如西安天隆科技公司的 TL 系列仪器。 二、Real-time qPCR 概述 1. Real-time qPCR 原理 实时 PCR 就是在 PCR 扩增过程中，通过荧光信号，对 PCR 进程进行实时 Real-time qPCR 手册手把手教你从菜鸟到高手 检测。一般来讲，定量 PCR 仪包括：实时荧光定量 PCR 仪主要由样品载台、基 因扩增热循环组件、微量荧光检测光学系统、微电路控制系统、计算机及应用软 件组成。其中基因扩增热循环组件工作原理与传统基因扩增仪大致相同，不同厂 家不同型号的产品分别采用空气加热、压缩机制冷、半导体加热制冷等工作方式。 独特是这个微量荧光检测系统。有由荧光激发光学部件、微量荧光检测部件、光 路、控制系统组成。常用的荧光激发方式有两种：卤钨灯和 LED；荧光检测元 件常用两种方式：光电倍增管和冷光 CCD 摄像机，光单色元件有滤光片和光栅。 在实