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第三章 细胞生物学研究方法 第一节 细胞形态结构的观察方法 一、光学显微镜技术 （一）普通复式光学显微镜技术 复式光学显微镜是实验室中最为常用的显微镜。 由3部分构成 ，即：①光学放大系统：两组玻璃透镜、目镜、物镜。是显微镜的主体 。 ②照明系统：光源、折光镜、聚光镜。 ③机械和支架系统：主要保证光学系统的准确配置和灵活调控。 显微镜物象是否清楚不仅仅决定于放大倍数，最关键的是决定于显微镜的分辨率。 分辨率：是指显微镜（或人的眼睛距目标25cm处）能分辨两质点间的最小距离。辨认两点之间的距离越小，则分辨本领愈高。 分辨率的大小决定于光的波长λ，物镜镜口角а和介质的折射率N ，他们之间的关系如下： D= R=0.61λ /N． sin（ а/2 ） 分析上式，要得到高的分辨力（D值小），方法有二:一是缩短波长，二是增大镜口率。 通常а最大值为 140?，普通光线的波长λ为400nm~700nm，介质折射率N（水：1.3；空气：1；香柏油：1.5 ） 因此显微镜分辨力数值不会小于0.2μm ，即光学显微镜的最大分辨率：0.2μm。即R=0·2μm是光镜的极限，显微镜无论制作的如何精密，都无法突破这一极限。 放大倍数： 是眼睛看到像的大小与对应标本大小的比值。 光镜有效放大倍数受到分辨力限制，只要将R=0.2μum，放大到人眼分辨力（0.2 mm）大小，便能观察该物体。0.2 mm ×103/0.2μm=103（倍），超过此界限继续放大，人眼就看不清其细节，是模糊的空放大，无意义。 所以一般显微镜设计的最大放大倍数通常为1000X。 ☆在使用正确匹配目、物镜，以保证物象清晰度。 （二）相差和微分干涉显微技术 利用光的衍射和干涉现象使得显微镜观察或细胞成为可能。 1.相差显微镜 是能将物体本身的相位差转换为振幅差的显微镜。在普通光镜下观察标本时，是靠颜色（波长）和亮度（振幅）的差别而看到被检物体的结构，而活细胞近于无色透明，光波通过不吸收光，振幅变化不大，故人眼感觉不到。 但相差显微镜可将相位差转变为振幅差为人眼所见。可以观察到未染色的活体细胞和组织的内部结构和变化。 2.微分干涉显微镜 （三）荧光显微镜技术 以紫外线为光源，照射被检物体发出荧光，在显微镜下观察形状及所在位置。 荧光显微镜可以观察细胞内天然物质经紫外线照射后发荧光的物质，如叶绿体中的叶绿素能发出血红色荧光。也可观察诱发荧光物质，如用丫啶橙染色后，细胞中RNA发红色荧光，DNA发出绿色荧光，根据发光部位，可以定位研究某些物质在细胞内的变化情况。 （四）激光扫描共焦显微镜技术 普通荧光显微镜：一焦平面荧光聚焦，焦平面以外的荧光便反差，分辨率降低。 激光扫描共焦显微镜：排除焦平面以外光的干扰，增强图像反差和提高分辨率(1.4—1.7)，可重构样品的三维结构。 系统经一次调焦，扫描限制在样品的一个平面内。调焦深度不一样时，就可以获得样品不同深度层次的图像，这些图像信息都储于计算机内，通过计算机分析和模拟，就能显示细胞样品的立体结构。 二、电子显微镜技术 （一）、电子显微镜的基本知识 1、电子显微镜与光学显微镜的基本区别 电镜与光镜区别主要在于： （1）光源不同 光镜为可见光或紫外线；电镜为电子束 （2）透镜不同 光镜为玻璃；电镜为电磁透镜 （3）真空度 真空 （4）显示记录系统 2.电子显微镜的基本构造： ①电子束照明系统 ②成像系统 ③真空系统 ④记录系统 （二）主要电镜制样技术介绍 1.超薄切片技术 因为电子束穿透能力有限，因此样品要很薄，即切片厚度40—50nm，超薄切片。 基本要求 （1） 细胞精细结构保存良好，不产生明显的物质凝聚、丢失或添加人工效应等； （2） 切片厚度在500埃左右，最大不超过1000埃（1mm厚的样品切成20000片；一个一般大小的细胞要切成300片） 颜色 厚度（埃） 暗灰色 ＜400 灰色 400—500 银色 500—700 金黄色 700—900 紫色 900以上 （ 3） 切片应耐受电子