肿瘤血管生成的分子机制常用研究方法课件.ppt

第二部分 体内实验 1.鸡胚绒毛尿囊膜实验 2.角膜微囊实验 3.海绵植入实验 4.圆盘血管生成系统 5.基质胶栓实验 6.海绵-基质胶实验 第三部分 整体实验 1.斑马鱼实验模型 2.爪蟾蝌蚪实验模型 3.肿瘤模型 第一部分 体外实验 1.血管内皮细胞分离培养方法 微血管内皮细胞分离方法主要有3种，包括酶消化法、机械分离法和磁珠分离法，最常用的是酶消化法。 酶消化法的优点是分离的细胞多，纯度较高，缺点是酶对某些表面蛋白有破坏作用；后两种方法可以避免酶对内皮细胞的损伤，缺点是其他细胞的污染可能性较大。 （下面以酶消化法为例） 第一步 分离 血管内皮细胞的分离是将剪碎的组织浸泡在消化酶中，因酶的消化一般是由外向里，所以最后被消化下来的细胞才是内皮细胞。因此，彻底地消化组织是获得足够微血管内皮细胞的前提，且非血管内皮细胞的污染是不可避免的。为了能分离获得足够的微血管内皮细胞，采用过量的酶消化是必要的。 　第二步 细胞的纯化 血管内皮细胞的分离过程中必然伴随非血管内皮细胞的污染，因此血管内皮细胞的纯化是决定血管内皮细胞培养成功与否的关键，也是血管内皮细胞培养的技术难度所在。 目前已经建立了多种微血管内皮细胞纯化的方法。 血管内皮细胞纯化的方法主要有： 1.用尼龙网或不锈钢网筛过滤细胞悬液、 2.物理刮除法、 3.生长特性选择法、 4.局部消化法、 5.差速黏附法、 6.免疫磁珠法等， 可以根据不同细胞的培养特性或生物特性选择其中几种方法进行纯化。 第三步 内皮细胞的鉴定 目前为止，还没有发现不同器官组织的血管内皮细胞具有共同的特异蛋白或标志。因此，血管内皮细胞的鉴定大多是根据器官和组织的起源，从形态、表型、生化和功能等方面进行综合评价。 血管内皮细胞一般呈单层生长，有接触抑制现象，呈典型的铺路石状，电镜下可以看到Weibel-Palade小体。其表面可以表达CD31、CD34、凝血调节蛋白和第Ⅷ因子等，可以摄取低密度脂蛋白，产生前列腺素(PGI2和PGE2)，表达E-选择素，内吞功能，结合植物血凝素，形成毛细血管样网络。 不管利用那种方法，培养的内皮细胞都可根据某些特征进行鉴定。内皮细胞可以利用其表面表达血管紧张素合成酶、摄取乙酰化低密度脂蛋白及第Ⅷ因子的表达进行鉴定。 内皮细胞在培养条件下可以形成管形，像原始血管形成或损伤后血管再生，这被认为是内皮细胞独有的特征。但有报道说培养的上皮也可以形成管形。因此，一般情况下研究者们采用最有利的方法获得高纯度的内皮细胞，并用多种方法进行鉴定。 血管内皮细胞的培养要点 根据血管内皮细胞的生长特性，需要采用一些特殊的培养条件，并且这些培养条件可能因为血管内皮细胞的起源不同而有所差异。血管内皮细胞的培养一般选用DMEM、M199等基础培养基，pH 7.2，添加150 mL/L～200 mL/L的胎牛血清、1000单位/mL双抗，20 g/L谷氨酰氨，还需添加内皮细胞生长因子(一般添加浓度为1%)。根据其接触抑制现象需及时进行传代培养。 2.内皮细胞增殖实验 2.1内皮细胞增殖检测 血管内皮细胞的增殖是血管发生的重要步骤。 目前,已有多种成熟的细胞增殖测定方法,如四氮唑盐还原法和[3H ]-胸腺嘧啶掺入法等细胞增殖测定方法。 2.1.1 四氮唑盐还原法(又称MTT 比色法) 是一种最常用的检测细胞存活和生长的方法。活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶使外源性MTT 还原为蓝紫色结晶甲瓒并沉积在细胞中,而死细胞无此功能。MTT 结晶形成量与细胞数成正比。 该方法已被用于检测内皮细胞增殖,并广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性实验以及肿瘤放射敏感性测定等。 2.1.2 [3H ]-胸腺嘧啶掺入法 是一种更好的测定细胞增殖的方法。将同位素氚标记的胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)作为DNA 合成的前体掺入到增殖细胞中,通过放射自显影观察细胞增殖情况。 2.2血管生成调控因子（生长/抑制因子）的检测 血管生成调控因子很多，但多数都是蛋白质，根据实验条件和需要可以从核酸水平或蛋白质水平进行检测: 2.2.1血管生长（抑制）因子核酸水平检测 RT-PCR检测血管生长（抑制）因子的mRNA表达：是以RNA为起始膜板产生cDNA,再以cDNA为膜板进行PCR扩增，获取目的基因或检测基因表达。（略） 2.2.2血管生长（抑制）因子蛋白质水平检测 2.2.2.1酶联免疫吸附试验（ELISA） 定义：用酶标记抗原或抗体检测液体（血液、细胞液