血液分子生物学细胞培养技术课件.ppt

科研实验技术石小玉 教授;显微技术 ;—、光学显微镜;（二）荧光显微镜 细胞中有些物质，受紫外线照射后可发荧光；另有一些物质本身虽不能发荧光，但如果用荧光染料或荧光抗体染色后，经紫外线照射亦可发荧光，荧光显微镜就是对这类物质进行定性和定量研究的工具之一。;荧光显微镜和普通显微镜有以下的区别： 1.? 照明方式通常为落射式，即光源通过物镜投射于样品上； 2.? 光源为紫外光，波长较短，分辨力高于普通显微镜； 3.? 有两个特殊的滤光片，光源前的用以滤除可见光， 目镜和物镜之间的用于滤 除紫外线，用以保护人目。;荧光显微镜照片（微管呈绿色、微丝红色、核蓝色） ;（三）激光共聚焦扫描显微境;激光共聚焦扫描显微镜 ;（四）倒置显微镜;二、电子显微镜;1. 基本原理;★ 电子显微镜与光学显微镜的成像原理基本 一样，所不同的是前者用电子束作光源，用电磁场作透镜。 ★ 由于电子束的穿透力很弱，因此用于电镜的标本须制 成厚度约50nm左右的超薄切片。这种切片需要用超薄 切片机（ultramicrotome）制作。 ★ 电子显微镜的放大倍数最高可达近百万倍。 ★ 电子照明系统、电磁透镜成像系统、真空系统、记录 系统、电源 系统等5部分构成。;2. 制样技术;2）负染技术 负染就是用重金属盐（如磷钨酸、醋酸双氧铀）对铺展在载网上的样品进行染色；吸去染料，样品干燥后，样品凹陷处铺了一薄层重金属盐，而凸的出地方则没有染料沉积，从而出现负染效果，分辨力可达1.5nm左右。; 3）冰冻蚀刻 ? 冰冻蚀刻（freeze-etching）亦称冰冻断裂（freeze-fracture）。标本置于-100?C的干冰或-196?C的液氮中，进行冰冻。 ? 用冷刀骤然将标本断开，升温后，冰在真空条件下迅即升华，暴露出断面结构，称为蚀刻（etching）。 ? 蚀刻后，向断面以45度角 喷涂一层蒸汽铂，再以90度角 喷涂一层碳，加强反差和强度。 ? 用次氯酸钠溶液消化样品，把 碳和铂的膜剥下来，此膜即为 复膜（replica）。 ? 复膜显示出标本蚀刻面的形态， 在电镜下得到的影像即代表标 本中细胞断裂面处的结构。;（二）扫描电子显微镜;人类血细胞SEM照片 ;显微操作/注射仪 ;细胞培养技术The techniques of cell culture;细胞培养的概念 摹拟体内生理环境，在无菌、适当温度和一定营养条件下，使细胞在体外生存并维持其结构和功能的方法。 选用最佳生存条件对活细胞进行培养和研究的技术。 ;细胞培养：使用单个细胞悬液 组织培养：使用组织块（O.5～1立方毫米）或薄片（厚0.2 毫米） 器官培养：使用器官原基或器官的一部分或整个器宫 ; 传代（passage） 细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种到新的培养器皿中。培养细胞的“一代”，不表示细胞分裂一次，而是指培养细胞从接种到再次转移培养的过程。在一次传代培养中，细胞能倍增3-6次。 原代培养 取自体内新鲜组织并置于体外条件下生长的细胞在传代之前称为原代培养。 原代培养细胞的生命归宿 原代培养期 传代期 衰退期 ;细胞系（cell line） ?原代培养物成功传代后，则称之为细胞系。 有限细胞系（finite cell line） ?细胞系的生存期有限。 无限细胞系（infinite cell line） ?已获无限繁殖能力能持续生存的细胞系。 ?无限细胞系大多已发生异倍化，具异倍体核型，有的可能已成为恶 性细胞，因此本质上已是发生转化的细胞系。 ? 无限细胞系有的只有永生性（或不死性），但仍保留接触抑制和无 异体接种致癌性。 ? 有的不仅有永生性，异体接种也有致瘤性 。; 永生性和恶变 * 永生性：是细胞获得持续生长增殖能力的特性 * 永生性的细胞不一定具有恶性, 但却易演变成 恶性细胞 ;细胞株（cell strain） ? 通过选择法或克隆形成法从原代培养 物或细胞系中获得具有特殊性质或标 志物称为细胞株。 ? 细胞株的特殊性质或标志必须在整个 培养期间始终存在。 ? 再由原细胞株进一步分离培养出与原