慢性胃炎脾虚证患者基因差异表达图谱研究-中西医结合临床专业毕业论文.docxVIP

广州中医药大学2 广州中医药大学2 006届博士学位论文 而随着人类认识水平的提高，随着遗传学和分子生物学的发展，大量研究资料表明， 人类许多疾病的发生发展都与某些相应的基因出现异常的扩增、重排、缺失、突变、 功能异常或表达异常有关；其中，基因表达水平的变化反映了机体特定阶段的生命特 征。研究表明不同的病或者证可能大多存在有其不同的基因组学基础和背景。 目前国内许多专家比较认可的是，人类基因组学的方法学内容与中医整体观、辨 证观有许多相似之处。脾虚证作为一系列复杂临床症状和体征的集中描述，在这些表 象背后，应该有其特定的生物学基础。就是说，可能有支持它的相应基因组学背景， 脾虚证可能具有相关基因的差异表达。本课题试图描绘出脾虚证的基因差异表达图 谱。 在中医证侯研究中，一直比较强调的一点就是，在对证的研究中要重视病与证的 结合。脾虚证的研究亦是如此。因此，如前所述，我们的研究选择了慢性胃炎作为研 究对象，把研究的目标锁定到慢性胃炎脾虚证。同时，对中医的同病异证的理论基础 进行探讨，实验选择慢性胃炎的脾虚证和脾胃湿热证进行对照研究，探讨同一慢性胃 炎两种不同证型的基因表达差异。 研究方法 1、病例选择 受试病例首先需要符合慢性胃炎诊断标准(临床、胃镜及病理诊断)，然后符合 脾虚证／脾胃湿热证辨证标准，同时要排除消化道器质性病变及其他系统严重病变者。 脾虚证辨证标准：主症：①舌质淡、舌体胖或有齿印，苔薄白；②胃纳减少或食 欲差；③腹胀；④大便溏或腹泻；次症：①消瘦；②体倦乏力；③脉细弱。判断：1) 主症①必备。2)兼具主症②、③、④之二；或兼具主症②、③、④之一，同时兼具 两个以上次症，诊断即可成立。 脾胃湿热证辨证标准：主症：①舌苔黄腻；②胸闷：③胃脘痞满或胀痛；④食欲 不振。次症：①口苦而粘；②口渴而少饮，或喜热饮；③大便溏，或有粘液；④恶心： ⑤身困乏力；⑥脉濡缓，或滑。判断：1)主症①必备。2)兼具主症②、③、④之二， 或兼具主症②、⑨、④之一，同时兼具两个以上次症；或兼具3个以上次症，诊断即 可成立。 正常健康者选择标准：临床辨证无明显异常，舌象脉象正常。胃镜下及病理检查 胃粘膜无明显病变者。 2、收集标本 在广州中医药大学第一附属医院和广东省中医院按照上述标准收集慢性浅表性 胃炎脾虚证患者作为试验组(脾虚)，慢性浅表性胃炎脾胃湿热证患者作为证型对照 组(脾胃湿熟)，从志愿者中选择健康人作为正常对照组(正常)。于广州中医药大学 第一附属医院胃镜室做胃镜检查。经胃镜下诊断也符合纳入标准后，胃镜下钳夹胃窦 慢性胃炎脾虚证患者基因差异表达图谱研究 慢性胃炎脾虚证患者基因差异表达图谱研究 摘要 部和十二指肠粘膜组织3至4块，生理盐水(RNase—free)清洗后，取一块置于10％ 福尔马林液中各做病理切片，其余于置于RNAlater中，液氮保存，以各制作表达谱 芯片BiostarH一140s。 3总RNA提取 将液氮保存的样品用碾钵碾磨成粉末状后，转移至已经加入适量UNlzol试剂的 匀浆管中匀浆。将匀浆液4C，12000 g，离一IZ,lO rain。小心吸取上清液，15-30。C放置 5 min。加入氯仿，震荡，15～30V放置3 min，4℃，12000 g，离一1：,15 rain。吸取上清， 加入异丙醇，充分混匀，15～30。C，放置10 min，4“C，12000 g，离一5qO rain。弃去上 清，缓慢加入75％Z|．醇5 m1，洗涤，小心弃去乙醇。再加入75％Z,醇10 IIll，短暂涡旋， 4C，8000 g离一6,10rain。小心弃上清，短暂离心，吸去上清，干燥沉淀5min。加入 RNase．free的Milli．Q水，完全溶解RNA沉淀后，取适量RNA采用核酸定量分析仪和 琼脂糖凝胶电泳检测质量，余．80℃保存。 4探针标记 按照UNIGENE芯片杂交试剂盒说明书操作如下：将配制好的预杂交液放入95℃ 水浴锅内变性2 min，将待预杂交的玻片放／k95C水浴锅内变性30 sec。将预杂交液加 到玻片内，放入杂交箱内42。C预杂交5--6hr。依次加入以下试剂(反应终体积为50p I， 以下试剂均为RNase--free)：23 u lddH20，5 u l逆转录引物，30-50 p g总RNA，振 荡混匀，置于70。C水浴10 min。取出后，迅速置于冰上。分别加入以下试剂：10 u l 逆转录酶缓冲液，5ⅡlDTT，4 ul dNTPs。在暗室中加入以下试剂：2 ul逆转录 酶，脾虚加3 gl Cy5一dCTP(正常加3 IX 1 Cy3一dCTP)，混匀样品，手浴2min。42C水 浴2 hr。依次加入标记试剂I 4 u l，65℃水浴10 rain后加入标记试剂II 4u l。混匀， 合并对照