棉花幼苗盐胁迫条件下Solexa转录组测序结果的分析及验证-生物化学与分子生物学专业毕业论文.docxVIP

山东农业大学硕士学位论文 山东农业大学硕士学位论文 棉花幼苗盐胁迫条件下 棉花幼苗盐胁迫条件下 Solexa 转录组测序结果的分析及验证 PAGE PAGE 1 PAGE PAGE 2 中 文 摘 要 盐胁迫是全世界范围内影响作物产量的最严重的非生物胁迫之一，利用基因工程提 高植物的耐盐性，培育出适合在盐渍化土地上生长的植物品种是有效利用盐渍化土地的 主要方法。棉花是一种生物学研究中常用的模式植物，盐胁迫会严重影响棉花的生长和 产量，尤其是在种子萌发和幼苗生长阶段。棉花耐盐的生理机制已经得到广泛的研究， 具体机理包括离子的平衡、渗透调节物质的积累以及抗氧化剂的积累。但是棉花耐盐的 分子机理研究较少，因此，深入研究棉花盐响应机理有助于利用基因工程手段提高棉花 的耐盐性。 本实验通过 Solexa 高通量测序的方法，对盐胁迫处理前后的棉花幼苗进行转录组测 序，通过分析大量的测序结果，发现了相当多受盐胁迫处理上调和下调的基因，揭示了 棉花幼苗盐处理前后转录组水平的复杂的调控网络。之后，利用 qRT-PCR 的方法对测 序结果进行了验证。并对 NaCl 处理后，上调非常明显的 4 个编码 LEA 蛋白的基因进行 表达模式的分析、基因的分离、系统发生分析和功能验证。主要实验结果和结论如下： （1）对照和盐处理两个 Solexa 测序样品分别检测到 3 583 646 和 3 694 330 个具有 信号的探针，各包含了 395 874 和 389 356 个特异性标签。通过排除假阳性标签，余下 的清晰标签分别为 145 794 和 138 518 个。通过对照棉花基因表达的数据库网站，分别 找到了 75 500（51.8%）和 72 077（52.0%）个匹配的标签。我们以 log2 值（变化倍数） 2 和-2、P-value 值（统计学有效值）0.001、FDR（错误发生率）0.01 作为筛选基 因的标准，找到了 223 个上调基因和 317 个下调的基因。其中，未知基因约占 45%。参 与不同信号通路的基因都发生了不同程度的上调和下调，表明它们在植物适应盐胁迫的 过程中发挥着重要的调节作用。 （2）利用 RT-PCR 的方法检测了 22 个基因的相对表达量，结果与测序结果基本一 致，表明转录组测序结果是可靠的。 （3）利用 qRT-PCR 的方法检测了 4 个 LEA 基因和 3 个已知的非测序结果筛选得 到的 LEA 基因的相对表达量，结果显示，4 个 LEA 基因受盐胁迫诱导上调的倍数要明 显高于其它 3 个 LEA 基因，表明这 4 个 LEA 基因在棉花耐受盐胁迫过程中发挥着主要 作用。4 个 LEA 基因的组织表达模式结果显示，M19406 受 NaCl 诱导的表达量显著高 于 TA24166_3635 和 X15086，且三者在真叶和根中的诱导表达模式一致；但 M19379 在真叶中几乎检测不到它的表达，而在根中受盐诱导表达显著。 （4）我们通过 RACE 的方法分离得到 4 个 LEA 基因的全长序列。利用 ClustalX 等 生物学软件，对 4 个棉花、18 个拟南芥和 14 个水稻的 LEA 蛋白基因进行系统发生分析。 结果显示，不同 LEA 蛋白组别之间差异较大，棉花的 4 个 LEA 基因 M19379、M19406、 TA24166_3635、X15086 分别从属于 dehydrin、PvLEA18、LEA_2、LEA_4 四个不同的 组别。 （5）在酵母中表达 M19379、M19406、TA24166_3635、X15086 四个 LEA 基因， 分别在固体和液体 YPG 培养基上进行胁迫抗性分析。结果显示，M19379、M19406、 TA24166_3635、X15086 均能不同程度的提高酵母菌株对盐胁迫、渗透胁迫和氧化胁迫 的抗性。初步验证了 4 个 LEA 基因在棉花对逆境的适应过程中发挥的作用，这为将 4 个 LEA 基因在拟南芥中过量表达，进一步研究其机理奠定了基础。 关键词：盐胁迫；棉花；Solexa 测序；实时定量 RT-PCR；LEA 蛋白；酵母 Transcriptional analysis of young cotton (Gossypium hirsutum) seedlings under salt stress via solexa sequencing Abstract Salinity is one of the most important factors that affect producitivity of crops in the world. Improving the salt tolerance of plants is the