棉花细胞质雄性不育机理的研究-作物学专业毕业论文.docxVIP

浙江大学 浙江大学 博士学位论文 棉花细胞质雄性不育机理的研究 摘要 植物细胞质雄性不育(cytoplasmic male steriltiy，CMS)是一种不能产生有 活力花粉的遗传现象，属母性遗传，在植物杂种优势利用中具有重要价值。棉花 细胞质雄性不育机理的相关研究报道不是很多，同玉米、水稻等作物雄性不育机 理研究相比，要远远落后。因此，开展棉花细胞质雄性不育的分子机理研究，便 于更好的利用棉花杂种优势，具有重要的理论和实践意义．哈克尼西棉 (Gossypum harknessii Brandegce)细胞质雄性不育是由细胞质基因控制的并可被 核恢复基因抑制的性状，其花药在造孢细胞增殖期就开始退化，并在花粉母细胞 减数分裂时期达败育高峰，进而花粉母细胞不能形成四分体，是一种无花粉粒的 雄性不育。这种雄性细胞退化旱、败育过程清晰和凋亡彻底的花药，既是杂交棉 制种的有利条件，也是雄性不育机理研究的良好材料。 为此，本文以哈克尼西棉雄性不育系和保持系花药为材料，通过比较花药线 粒体超微结构、与CMS相关的线粒体基因序列及基因表达、线粒体代谢酶类的 生化分析、线粒体活性氧代谢变化及活性氧清除酶基因的表达，寻找与棉花细胞 质雄性不育相关的基因，并探讨细胞质雄性不育产生的可能的分子机理。研究主 要结果如下： 1．通过对棉花不育系和保持系不同发育时期花药的超微结构观察，发现不 育系花药在造孢细胞增殖期，线粒体就已出现异常，表现为轻微肿胀，出现电子 透明区。在小孢子母细胞形成期普遍表现出线粒体体积膨胀、内嵴模糊、线粒体 空泡化、基质淡化等异常现象，进入减数分裂时期后，线粒体、液泡等细胞器逐 渐解体、消失。在不育系小孢子发育不同时期观察到无嵴或嵴不发达乃至空泡化 的线粒体，这些线粒体不能行使正常代谢功能，以致ATP产生受到限制，能量 供应不足，最终导致花粉败育。所以，线粒体的结构异常是棉花细胞质雄性不育 系小孢子败育的重要细胞学特征。 。2．通过同源克隆方法，在棉花不育系和保持系线粒体基因组中克隆与CMS 相关的线粒体基因，发现线粒体atp6、atp9、had3、nad6、had9、cob、coxI和 coxll基因片段的核苷酸序列在不育系和保持系中没有差异，但是线粒体基因 coxlll在不育系和保持系中存在碱基突变．不育系和保持系线粒体coxlll基因全 Ⅱ 浙扛大学 浙扛大学 博士学位论文 棉花细胞质雄性不育机理的研究 部编码序列大小没有差异，都为798bp，但序列内部有5个碱基发生了突变，其 中3个碱基突变造成编码的氨基酸发生了变异。与保持系相比，不育系coxIH基 因编码区的AⅢ、c掷、A3酤、c442和寸16分别被替换为c、T、c、A和c。根 据核苷酸序列推导棉花coxLH基因编码265个氨基酸。不育系coxIll基因推导的 氨基酸Ser62、Lysl22、Thrl档分别被Arg、Asn和Am替代，而scr85和Leul72因 存在密码子简并现象未发生变化，不育系在coxH．[基因上既发生了错义突变又发 生了无义突变。经同源性分析，发现棉花不育系coxHJ基因的核苷酸序列，与拟 南芥、油菜、烟草和玉米等coxI．[1基因的核苷酸序列相比，它们的序列同源性都 高达95％。 利用RT-PCR和荧光定量RT-PCR方法研究上述与CMS相关的线粒体基因 的表达时，发现在整个花药发育过程中，与CMS相关的线粒体基因在不育系中 的表达量总体上要低于保持系。在花药败育高峰期(花粉母细胞减数分裂期)， 与CMS相关的线粒体基因在不育系花药中的表达量要显著低于保持系。 3．通过对不育系和保持系叶片、花药细胞色素氧化酶的活性和同工酶活性 测定，以及细胞色素氧化酶的细胞化学定位分析，发现不育系和保持系叶片细胞 色素氧化酶的活性和同工酶活性没有明显差异，而在花药组织中存在显著差异。 在花药败育初期(造孢细胞增殖期)，不育系花药中细胞色素氧化酶活性、同工 酶活性和线粒体膜上嗜锇颗粒的数量与对应的保持系没有显著差异。在花药败育 高峰期，不育系花药细胞色素氧化酶活性和同工酶活性要显著低于保持系花药， 不育系花药线粒体膜和靖上嗜锇颗粒的数量要明显少于保持系花药。在花药败育 后期，不育系花药细胞色素氧化酶的活性同保持系相比差异不显著。棉花不育系 细胞色素氧化酶活性的降低可能与小孢子的败育和雄性不育的发生有重要联系。 4．通过测定不育系、保持系和杂种F1叶片、花药及其线粒体活性氧含量、 活性氧清除酶的活性，以及抗氧化酶基因的表达分析，发现叶片活性氧的含量和 活性氧清除酶的活性在不育系、保持系和杂种Fl中没有显著差异。在花药败育初 期，不育系花药中活性氧含量稍高于保持系，活性氧清除酶的活性和抗氧化酶基 因的表达水平与保持系没有明显差异。但在花药败育高峰期，不育系花