罗氏沼虾雌激素相关受体的克隆与表达及壬基酚对其表达的影响-水产养殖学专业毕业论文.docxVIP

广东海洋大学 广东海洋大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所敬得 的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个 人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个人和集 体，均己在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承 担。 作者签名：越齿轰 2。后年石月g日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校 保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和 借阅。本人授权广东海洋大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数 据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于1、保密口，在——年解密后适用本授权书。 2、不保密团。 (请在以上相应方框内打“J”) 作者签名：赵甚鑫 2D，6年多月 莎曰 别磁氢,I象／I解、／I’∥I 弘f二年6月g日 万方数据 罗氏沼虾雌激素相关受体的克隆与表达及壬基酚对其 罗氏沼虾雌激素相关受体的克隆与表达及壬基酚对其 表达的影响 摘要 雌激素是一种性类固醇激素，在动物体内发挥着十分重要的生理作用，主要 是通过雌激素受体来介导发挥其相应的雌激素功能。性腺发育是由众多调控因子 共同作用完成的，其中雌激素及其受体己经被认为是卵巢发育的重要调控因子中 的一部分。在无脊椎动物中却未发现雌激素受体(estrogen receptor，ER)的存在， 却存在另一个同源性极高的基因，故而命名为雌激素相关受体(estrogen related receptor，ERR)。但目前在甲壳动物发育过程中对雌激素相关受体的研究尚未有 过多报道，因此对此类核受体的研究更有利于阐述雌激素参与其上下游的信号通 路。 本文拟用罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)作为该研究的实验用虾， 展开了对雌激素相关受体的相关研究。利用同源克隆的方法以及RACE技术， 克隆得到了罗氏沼虾雌激素相关受体的cDNA全长，使用半定量PCR (SqRT．PCR)的方法检测ERR在雌雄个体中组织分布，利用实时荧光定量PCR (qPCR)技术检测不同浓度壬基酚暴露以及不同时间处理对罗氏沼虾雌虾卵巢 中ERR mRNA表达量的影响。采用生物信息学方法分析ERR基因开放阅读框序 列、保守区和同源性等，并构建原核表达载体pET．32a．ERR，使用镍柱亲和层析 表达产物从而纯化目的蛋白。主要研究结果如下： 1．罗氏沼虾ERR基因的cDNA克隆及序列分析 罗氏沼虾ERR基因的cDNA序列全长为1897 bp，包含了一段长1374 bp的 开放阅读框(ORF)，143 bp的5-UTR和380 bp的3-UTR，编码了457个氨基 酸残基，分子量50．75 kDa。氨基酸序列分析表明，罗氏沼虾雌激素相关受体含 有核受体家族典型的结构域。 2．罗氏沼虾ERR基因的组织表达差异研究 组织分布结果表明，ERR在雌虾心脏和卵巢中表达量较高，在脑神经节和 肝胰腺中信号较弱，而在眼柄、肌肉和鳃中未见表达；ERR在雄虾心脏中表达量 较高，在脑神经节、肝胰腺、精巢、鳃中表达量较低，而在眼柄和肌肉中亦未见 明显信号，推测ERR可能在卵巢发育中发挥了重要作用。 3．壬基酚对罗氏沼虾ERR mRNA表达的影响 用不同浓度NP(5，25和125¨g／L)在体暴露罗氏沼虾两周后，发现所有处 万方数据 理组均能显著促进卵巢ERR 理组均能显著促进卵巢ERR mRNA的表达(P0．05)，当处理浓度超过25肛g／L 时，壬基酚发挥的雌激素效应将维持稳定；以25斗g／L的NP在体暴露罗氏沼虾， 数据分析显示，NP暴露6天时ERR mRNA的表达量已有显著增加，随着处理时 间的增加，ERR mRNA的表达量均能极显著提高，其中18天达到峰值，尽管18 天后依然相对于对照组ERR表达量显著增加，但是雌激素效应稍有下调趋势。 4．ERR基因的原核表达与纯化 将ERR基因ORF序列克隆至原核表达载体pET．32a中，构建了重组表达载 体pET一32a-ERR，经过条件优化，最终在温度为37。C，0．1 mmol／L的IPTG，诱 导时间为4 h，摇床培养的转速为200 rpm的条件下对目的蛋白进行大量诱导表 达，表达产物经纯化、SDS—PAGE检测，获得与预期大小相符的70 kDa重组蛋 白。 综上所述，本文对罗氏沼虾ERR基因进行了初步研究，并探索了环境内分 泌干扰物对其表达调控作用；建立了原核表达体系，并获得ERR蛋白，为下一 步目的蛋白的功能验证，多克隆抗体的制备等研究奠定了基础，为研究ERR在 罗氏沼虾发育过程中的调控机制提供了基础数据。 关键词：罗氏