棉花遗传转化体系的优化及突变体的创制-作物遗传育种专业毕业论文.docxVIP

棉花遗传转化体系的优化及突变体的创制棉花遗传转化体系的优化及突变体的创制 棉花遗传转化体系的优化及突变体的创制 棉花遗传转化体系的优化及突变体的创制 摘要 棉花是重要的经济作物，利用遗传工程技术改良棉花品种能够提高棉花的种植 效益。然而目前棉花的生物技术的发展仍然存在着很多障碍，主要表现在棉花体细 胞胚胎发生对基因型依赖性很强、周期长、导致再生植株的体细胞变异很严重：棉 花遗传转化技术的复杂性(难重复、转化率低)和转基因棉花的农艺性状的变异等 等，这些问题已经成为棉花生物技术、棉花功能基因的验证和棉花相关基因克隆等 研究领域的瓶颈。本研究内容主要涉及棉花高体细胞胚胎发生能力基因型的筛选、 棉花体细胞无性系变异研究、高效棉花遗传转化体系的建立，棉花胚芽为转化受体 的新的转化方法以及一个小型的promoter-trap插入突变体库的建立，旨在为转基因 棉花育种、功能基因组研究提供理论指导。主要研究结果如下： 1对三十个优良棉花基因型进行离体培养，系统地比较了它们的体细胞胚胎发生能 力。筛选到两个体细胞胚胎发生能力明显高于珂字棉的基因型一‘豫668’和‘豫 早1号’，这两个基因型能够在两个月内获得高频率的体细胞胚胎发生，为棉花的遗 传工程的发展拓宽了受体范围。 2棉花体细胞无性系变异的研究。利用细胞学压片、流式细胞仪检澳l及RAPD技术 对棉花体细胞胚胎发生获得的再生植株的遗传稳定性进行了评估，研究发现随机挑 选的14个再生植株的DNA倍性、染色体数目没有发生变异，而利用187条RAPD 引物对再生植株进行检测发现50％再生植株(14株中的7株)存在RAID扩增多 态性，这意味着细胞学水平的遗传变异与DNA水平的遗传变异没有必然联系。在 国际上首次利用RAPD和SSR技术对2，4-D+KT和IBA+KT这两种激素组合诱导 的胚性愈伤的遗传稳定性进行了检测。发现两者诱导的胚性愈伤组织胚胎发生能力 没有明显差异，但2，禾D+Kr组合诱导到的胚性愈伤组织在DNA水平上的变异程 度要比IBA+KT组合诱导的胚性愈伤组织高。 3农杆菌介导棉花胚性愈伤转化体系的优化及以GFP为报告基因对棉花下胚轴遗传 转化的观察． 预培养15 d的棉花胚性愈伤组织是较好遗传转化受体材料，对转化的影响因子 进行比较实验，结果表明利用OD值为O．5的农杆菌菌液，在共培培养基中加入 50mg／L的乙酰丁香酮，19(3下，暗培养48小时，用100 m酽的卡那霉素进行选择， 400 m酿的头孢霉素抑制农杆菌的生长能够获得较高的转化效率。利用这些参数转 化能够使胚性愈伤组织转化率达到15．0％左右。 为了克服棉花转基因植株移栽困难的不利影响，建立了一种新的试管苗嫁接移 栽技术。以棉花去壳种子消毒后在培养基中萌发的无菌苗作为砧木，在无菌条件下， 华中农业大学2006届肄士学位论文将转基园顶芽，或者侧芽，嫁接到无菌苗的下胚轴上，在试管内萌发新根和新叶， 华中农业大学2006届肄士学位论文 将转基园顶芽，或者侧芽，嫁接到无菌苗的下胚轴上，在试管内萌发新根和新叶， 然后逐步移栽到大田中，这种试管内嫁接的技术有效地避免了环境因子对试管苗嫁 接成活的影响，将转基因试管苗的移栽存活率提高到90％以上，同时将移栽时间缩 短到20 d左右。 以GFP为报告基因研究农杆菌介导的棉花下胚轴遗传转化的整个过程，发现 GFP瞬时表达主要发生在下胚轴切口处的初生维管组织中，表皮细胞也有表达，而 稳定转化主要发生在切口处初生维管组织中，表皮细胞稳定转化的频率极低。G即 瞬时表达与稳定表达率是有关联但不等同的两个事件，在提高报告基因瞬时表达率 的同时，尽量减少农杆菌对外植体的毒害，才能真正提高转化效率。抗性愈伤组织 绝大多数是由转化的和非转化的细胞构成的嵌合体，在诱导的前两个月左右，转基 因细胞团和非转基因细胞团增殖速度都很慢，两个月后，部分转化细胞团，呈现爆 发式增长，直到分化。不同基因型材料的遗传转化特性有一定差异，转化的愈伤组 织需要在高激素浓度的条件下才能够分化． 4新的转化方法的探讨 利用萌发24 h的棉花种子的胚芽，作为转化受体材科，进行超声波辅助农杆菌 转化处理，能够将GFP基因在胚芽的瞬时表达率提高100多倍，利用这种技术，获 得了两个转抗虫基因的抗性植株。 5 promoter-trapping突变群体的初步研究。 通过根癌农杆菌转化棉花胚性愈伤组织，在国际上首次利用T-DNA将promoter- trapping系统导入棉花基因组，获得了713个独立的转化子。GUS染色发现，报告 基因GUS在不同的组织器官中均能表达，而且表达的模式多样。对T--DNA插入 拷贝数进行了研究，发现T_DNA以单拷贝插入为主，平均每个转化子中有1．8 ToDNA 拷贝。同时对To代T-DNA插入群