马动脉炎病毒非结构蛋白nsp4抑制IFn-β产生的分子机制研究-预防兽医学专业毕业论文.docxVIP

马动脉炎病毒非结构蛋白nsWt抑制IFN-IB产生的分子机制研究3．2．7大肠杆菌感受态细胞的制备(氯化钙法)．193．2．8连接产物的转化193．2．9重组质粒的制备与鉴定203．2．10质粒的转染(脂质体介导的瞬时转染法)．．203．2．1 1双荧光素酶报告基因检测．213．2．12 Western Blot检测目的基因在真核细胞中的表达213．2．1 3统计学方法．23第4章结果与分析．．244．1 EAV nsp4真核表达质粒的构建．244．2 EAV nsp4抑制SeV诱导的IFN．D产生244．2．1 EAV nsp4抑制SeV诱导的IFN—D启动子活性。244．2．2EAV nsp4抑制SeV诱导的IFN．D mRNA表达．．254．3超表达EAV nsp4对ISGs产生的影响。254．4探究EAV nsp4抑制IFN．D产生的分子机制274．4．1超表达EAV nsp4对NF．r,B和IRF3启动子的影响．274．4．2超表达EAV nsp4对p65和IRF3磷酸化的影响274．5 EAV nsp4对IFN．B的抑制依赖其3C样丝氨酸蛋白酶活性284．6探究EAV nsp4抑制IFN．B产生的作用靶标294．6．1 EAV nsp4扰乱RIG—I／MDA5信号通路294．6．2 EAV nsp4的作用靶标是NEMO．．304．7探究EAV nsp4对NEMO的切割是否依赖其3C样蛋白酶活性30第5章讨论与结论一325．1讨{念．325．1．1 EAV nsp4可以抑制I型干扰素的产生325．1．2 EAV nsp4扰乱RIG—I／MDA5信号通路335．1．3 EAV nsp4可以切割NEMO一335．1．4 EAV nsp4切割NEMO至少有4个位点．335．2结论．34参考文献一35致谢．44Il万方数据马动脉炎病毒非结构蛋白nsp4抑制IFN-B产生的分子机制研究摘要马动脉炎病毒(equine arthritis virus，EAV)属于动脉炎病毒科，为单股正链RNA病毒，可以引起马的病毒性动脉炎。EAV基因组共编码8个结构蛋白和至少13个 非结构蛋白。其中非结构蛋白nsp4是一种典型的3C样丝氨酸蛋白酶，具有切割活性。根据报道，nsp4的三维结构有已知最小的胰凝乳蛋白酶样折叠，还有一个典型的三联体催化中心(Ser-120，His一39和Asp一65)。I型干扰素是宿主细胞在病毒感染时产生的最主要的抗病毒细胞因子，之前的研 究发现EAV可以抑制IFN．B的产生，但具体的作用机制尚不清楚。有文献报道，甲 肝病毒和151蹄疫病毒的3C蛋白酶都可以通过其切割活性来抑制IFN．D的产生，那么 EAV的3C样蛋白酶即nsp4是否也可以抑制IFN—D的产生昵?鉴于此，本论文以EAV nsp4为研究对象，初步探讨了其对IFN．p产生的影响，并进一步解释了其作用机制，主要研究内容如下：1．超表达EAV nsp4抑制IFN．B的产生及干扰素刺激基因的表达将构建的EAV nsp4的真核表达质粒转染HEK293一T细胞，分别用双荧光素酶报 告系统和Real—time PCR检测超表达nsp4对SeV诱导的IFN．D产生的影响，结果表 明EAV nsp4在启动子水平和mRNA水平均能够显著抑制IFN．p的产生。我们的研 究还发现EAV nsp4可以显著抑制ISGl5、ISG20、ISG54和ISG56等多种ISGs的表 达。2．EAV nsp4通过抑制NF—KB和IRF3信号通路进而抑制IFN．p的产生干扰素调节因子3(IRF3)和核转录因子．v,B(NF．r,B)是调节IFN．D产生的两 个重要转录因子，为了阐明EAV nsp4是通过哪个转录因子来抑制IFN．p的产生的， 我们利用双荧光素酶报告系统和Western Blot实验检测超表达EAV nsp4对这两个转 录因子的影响。双荧光素酶检测结果表明，nsp4可以在启动子水平显著抑制IRF3 和NF．KB的活化，并且呈现一定的剂量依赖性；Western Blot结果表明nsp4可以抑 制IRF3以及p65的磷酸化。这就说明EAV nsp4是通过抑制IRF3和NF．r．B两个转 录因子的活性进而抑制IFN．D的产生。3．EAV nsp4对IFN．P的抑制依赖其3C样丝氨酸蛋白酶活性EAV nsp4是一种典型的3C样丝氨酸蛋白酶。为了探究nsp4对IFN．p的抑制是 否与其3C样蛋白酶酶活性是否有关，我们构建了EAV nsp4的3个酶活性位点突变 体，即nsp4一H39A，nsp4．D65A和nsp4．S120A。双荧光素酶报告系统检测结果表明， 与野生型的EAV nsp4相比，nsp4的酶活性位点突变体对IFN．B的抑制作用明显减弱， 这就表明EAV nsp4对IF