土壤分离提纯方案.docVIP

普通生物学实验——土壤放线菌的分离提纯 PAGE 土壤放线菌的分离提纯 土壤中的细菌多种多样，在无菌操作的基础上，利用土壤溶液在培养基上培养微生物，通过对放线菌的基本特征鉴定，再进行画线分离纯化的操作，最后利用染色法在显微镜下观察菌体的形态。通过理论的知识解决实践中的问题，提高实验能力，达到实验的目的。 一、实验目的 学会选择放线菌采样点并合理取样； 掌握高氏一号培养基的配制方法； 学习分离纯化放线菌的基本操作技术，掌握微生物培养方法以及接种技术，学会放线菌纯培养的确定； 学会使用高压蒸汽灭菌锅、显微成像系统等实验仪器设备； 培养并学习微生物实验的一般思维及方法。 二、 实验原理 放线菌是指能形成分枝或菌丝体的一类革兰氏阳性细菌，主要的分布源是土壤，链霉菌是其优势菌群。 从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一类微生物的过程称为微生物分离与纯化。平板分离法普遍用于微生物的分离与纯化。其基本原理是选择适合于待分离微生物的生长条件，如营养成分、酸碱度、温度和氧等要求，或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物（本实验不采用添加抑制剂）。 培养基是人工地将多种物质按各种微生物生长的需要配制而成的一种混合营养基质，用以培养或分离各种微生物。因此，根据微生物的生长习性及所需的营养元素而配制不同的培养基。微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落，通常是由一个细胞繁殖而成的集合体。因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。需要指出的是，从微生物群体中经分离生长在平板上的单个菌落并不一定保证是纯培养。因此，纯培养的确定除观察其菌落特征外，最好再结合显微镜检测孢子生长状况及个体形态特征。 土壤是微生物生活的大本营，它所含微生物无论是数量还是种类都是极其丰富的。因此土壤是微生物多样性分布的重要场所，是发掘微生物资源的重要基地，可以从中分离、纯化得到许多有价值的菌株。本实验将采用高氏1号培养基从土壤中分离放线菌。 三、实验器材 1. 培养基的配制： 放线菌的选择性分离实质上式处理目的菌株与非目的菌株的关系，要使培养基的设计尽可能具有选择性，有利于目的菌株的生长，而抑制非目的菌株的繁殖。根据放线菌的生长条件，选择使用高氏1号培养基： 试剂：可溶性淀粉：20g，KNO3：1g，NaCl：0.5g，K2HPO4·3H2O： 0.5g，MgSO4·7H2O：0.5g，FeSO4·7H2O：0.01g 方法：先用少量水将淀粉溶入烧杯中，搅拌至完全溶解，再依次加入其他成分进行溶解，最后加水至1000mL。调节pH 7.2～7.4，加入琼脂，搅拌至完全溶解。待用。 2. 仪器及其它用品 小铲，25.mL三角锥形瓶，250mL烧杯，药勺，无菌培养皿，剩9mL无菌水试管5支，盛45mL无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶，无菌玻璃珠，接种环，酒精灯，称量纸，高压蒸汽灭菌器，超净工作台，培养皿，移液器，分析天平，恒温震荡仪，微波炉显微成像系统，。 四、实验步骤与方法 1. 土壤取样 放线菌主要分布在土壤中，研究表明，原生林等原生环境中放线菌的多样性很丰富，另外，在极端环境如高盐、要酸碱、高低温、高辐射等地方也存在许多未知的放线菌。由于条件的限制，本实验取学校体育馆附近原生林土壤（树木下）作为土样。 2.仪器灭菌 将培养基溶液的三角瓶用报纸包扎好、试管、三角锥瓶，玻璃珠放到高压灭菌锅进行高温蒸汽灭菌。 3. 制备土壤稀释液 称取土样5g，放入盛45ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶中，用震荡仪恒温振摇约20分钟，使土样与水充分混合，将细胞分散，即配制成10-1土壤溶液。用一支1ml无菌吸管从中吸取1ml土壤悬液注入盛有9ml无菌水的试管中，吹吸三次，使充分混匀。然后再用一支1ml无菌吸管从此试管中吸取1ml注入另一盛有9ml无菌水的试管中，以此类推制成10-3、10-4各种稀释度的土壤溶液。 4．培养基的制备 （1）倒平板 将配制好的高氏1号琼脂培养基于高压蒸汽灭菌锅中高温消毒灭菌，待冷却至55—60℃时，往高氏1号培养基中加入1ml的0.5%重铬酸钾, 然后分别倒平板。方法是在超净工作台，右手持盛培养基的三角烧瓶，置火焰旁边，左手拿平皿并松动瓶塞，用手掌边缘和小指、无名指夹住拔出。令三角瓶瓶口在火焰上灭菌，左手将培养皿盖在火焰附近打开一缝，迅速倒入培养液约15ml，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布，平置于桌面上，待冷凝后即成平板。共制备6 （2）取样 在6个平板底面分别用记号笔写上10-3和10-4两种稀释度，然后用3支1ml无菌吸管分别由稀释度为10-3和10-4土壤稀释液中吸取0.2ml对号放入已写好稀释度的平板中，各加入几个已灭菌的玻璃珠，轻轻晃动，涂布均匀，然后将玻璃珠取出。将平板倒