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拟南芥报告基因检测的原理和意义 　　荧光素酶报告基因原理：转录因子是一种具有特殊结构、行使调控基因表达功能的蛋白质分子，也称为反式作用因子。某些转录因子仅与其靶启动子中的特异序列结合，这些特异性的序列被称为顺式作用元件，转录因子的DNA结合域和顺式作用元件实现共价结合，从而对基因的表达起抑制或增强的作用。荧光素酶报告基因实验是检测这类转录因子和其靶启动子中的特异顺序结合的重要手段。　　其原理简述如下：　　构建一个将靶启动子的特定片段插入到荧光素酶表达序列前方的报告基因质粒，如pGL3-basic等。　　将要检测的转录因子表达质粒与报告基因质粒共转染293细胞或其它相关的细胞系。如果此转录因子能够激活靶启动子，则荧光素酶基因就会表达，荧光素酶的表达量与转录因子的作用强度成正比。　　加入特定的荧光素酶底物，荧光素酶与底物反应，产生荧光，通过检测荧光的强度可以测定荧光素酶的活性，从而判断转录因子是否能与此靶启动子片段有作用。　　步骤：　　1、(1)铺细胞于24孔板中，{选用48孔板，铺板密度约为30%。}每孔细胞数为20万细胞左右，待细胞融汇度达到70%、85%时进行转染。一般选用细胞密度为50-70%时进行转染。转染体系的配置：目标蛋白的质粒，luc质粒，fermentas转染试剂，这个比例根据细胞、质粒转染难易程度而定，必要时需要自己摸条件）。——此步骤与与普通的细胞转染实验的要求相同。　　脂质体法　　在细胞密度达到80%左右，于转染前1小时用基本培养基为细胞换液。【对转染后易死的细胞可用不含双抗但含有10%FBS的DMEM或1640培养基】　　根据细胞培养皿的大小，按下表配制转染试剂体系。将适量欲转染的质粒　　DNA与适量体积的Opti-MEM混匀。同时，将适量的脂质体【采用下表中所给量的一半】也和适量的Opti-MEM混合。室温静置5分钟【时间过长会降低脂质体活性】。　　将中两溶液转移到同一EP管中，吹打使其混匀。静置20分钟。　　将质粒DNA和脂质体混合液加入到细胞培养皿中，置于CO2培养箱中37℃　　培养4－6小时后更换正常培养基。脂质体法各试剂用量　　2在转染合适的时间点，换成含血清基本培养基培养24小时左右，再根据实验需要处理细胞。　　3加Reporterlysisbuffer裂解细胞之前弃去培养液，500μl预冷的PBS清洗细胞两次，吸尽PBS。——荧光酶的酶促反应会被痕量的钙所抑制，故用磷酸钙转染的细胞在收集细胞前应充分洗涤除去含钙介质。　　4每孔中加入120μl1×Reporterlysisbuffer。室温放置2-5分钟裂解细胞，将24孔板放在-80℃冰箱，待测定时，室温放置，将其融化。——-80℃到室温的单次冻融有助于细胞裂解。　　5利用Luciferaseassaykit试剂盒测定荧光素酶的活性：取20μl细胞裂解上清液，加入荧光素酶底物50μl，迅速混匀，测定荧光素酶的活性。—一个样品做三个平行实验，在上清液与荧光素酶底物迅速、充分混匀的同时保证每份样品加入酶标板的时间间隔一致。　　裂解—加荧光素酶试剂　　1）5XlysisinddH2o，稀释到1X。　　60ulX51(48孔板ddH2o2448ul　　lysis5X612ul　　每孔60ul裂解细胞，　　于-80°C10min,4°C10min,反复冻融易于裂解。　　2）fireflyluciferasesubstrate　　luciferase1X2290ul　　Luci(棕色管)10X255ul　　ATP500X5ul　　每个孔加50ulluciferase于双报告基因仪器检测。　　3）Renillasubstrate　　50ulX50=stopbuffer(CTZbuffer)1X2225ul　　stop10X250ul　　slip(棕色管)100X25ul　　再加50ulrelina于双报告基因仪器检测　　6β-半乳糖苷酶活性的测定：取10μl细胞裂解液，加入120μl下面混合的试剂：3μl100×Mg、66μlONPG、200μlM磷酸钠缓冲液，在37℃温育30分钟左右，至液体颜色变黄。最后加入50μlNa2CO2终止反应，测定OD420。　　(7)荧光素酶的活性和β-半乳糖苷酶活性的比值即为报告基因的数值。　　仪器安装　　双击Veritas图标运行软件；　　从WelcometoVeritas对话框中点击RunPromegaProtocol；　　浏览DLR文件夹，选择合适的检测程序，例如DLR检测中使用的是单注射器那就选择DLRwithoneinjection.；　　点击Options选择需要检测的孔，默认值是预置了Promega操作方案的最佳测量值。但也可