微量凯氏定氮法实验报告.docxVIP

微量凯氏定氮法实验报告 　　姓名***学号***系年级11级生物基地组别**同组者***　　科目细胞生物学实验题目蛋白质浓度测定日期　　蛋白质浓度测定　　【实验目的】　　1.掌握凯氏定氮法测定蛋白质含量的基本原理和方法。　　2.学会使用凯氏定氮仪。掌握凯氏定氮法的操作技术，包括样品的消化处理、蒸馏、滴定及蛋白质含量计算等。　　【实验原理】　　蛋白质是含氮的化合物。凯氏定氮法首先将含氮有机物与浓硫酸共热，经一系列的分解、碳化和氧化还原反应等复杂过程，最后有机氮转变为无机氮硫酸铵，这一过程称为有机物的消化。为了加速和完全有机物质的分解，缩短消化时间，在消化时通常加入硫酸钾、硫酸铜、过氧化氢等试剂，加入硫酸钾可以提高消化液的沸点而加快有机物分解，硫酸铜起催化剂的作用。使用时常加入少量过氧化氢作为氧化剂以加速有机物氧化。消化完成后，将消化液转入凯氏定氮仪反应室，加入过量的浓氢氧化钠，将NH4+转变成NH3，通过蒸馏把NH3驱入过量的硼酸溶液接收瓶内，硼酸接收氨后，形成四硼酸铵，然后用盐酸标准溶液滴定，直到硼酸溶液恢复原来的氢离子浓度。滴定消耗的标准盐酸摩尔数即为NH3的摩尔数，通过计算即可得出总氮量。在滴定过程中，滴定终点采用甲基红-次甲基蓝混合指示剂颜色变化来判定。测定出的含氮量是样品的总氮量，其中包括有机氮和无机氮。以甘氨酸为例，其反应式如下：　　NH2CH2COOH+3H2SO4→2C02+3SO2+4H2O+NH32NH3+H2SO4→(NH4)2SO4　　(NH4)2SO4+2NaOH→2H2O+Na2SO4+2NH3↑　　反应，在凯氏烧瓶内完成，反应凯氏蒸馏装置中进行。蛋白质是一类复杂的含氮化合物，每种蛋白质都有其恒定的含氮量。凯氏定氮法测定出的含氮量，再乘以系数，即为蛋白质含量。　　【实验材料】　　1.试剂：牛奶；浓硫酸；CuSO4催化剂；标准品(NH4)2SO4；2％硼酸；/mlHcl；30％NaOH；甲基红指示剂。　　2.器材：　　图1微量凯氏定氮装置图2酸式滴定管　　1.电炉；2.蒸汽发生装置；3.螺旋夹；4.小漏斗及棒状玻璃塞；　　5.反应室；6.反应室外层；7.橡皮管及螺旋夹；8.冷凝管；9.蒸馏液接收瓶此外还有三角瓶；移液管、5ml移液管；12.洗耳球；　　13.大烧杯；14.吸管；15沸石；16.洗瓶；17.凯氏烧瓶；100ml容量瓶　　【实验步骤】　　1.样品消化　　量取牛奶样品2ml于干燥的凯氏烧瓶中，加入3ml浓硫酸和200mg催化剂，将瓶以450角斜支于有小孔的石棉网上，使用万用电炉，在通风橱中加热消化。开始时用低温加热，待内容物全部炭化，泡沫停止后，再升高温度保持微沸，当消化液呈淡黄色时，冷却，加入2滴H2O2，继续加热，消化至液体呈蓝绿色澄清透明后，取出冷却，冷却后，无损地转移到100mL容量瓶中，加水定容至刻度，混匀备用，即为消化液。　　试剂空白：向凯氏烧瓶内加入1ml蒸馏水，加入与样品消化相同的浓硫酸和催化剂，按以上同样方法进行消化，冷却，加水定容至100mL，得试剂空白消化液。　　2.仪器洗涤　　在蒸气发生瓶内装如约三分之二的自来水，加甲基红指示剂数滴，再加入数毫升硫酸，直至溶液呈粉红色，以保持水呈酸性，加入数粒玻璃珠防止暴沸。测定前定氮装置如下法洗涤2~3次：从样品进口入加水适量通入蒸汽煮沸，产生的蒸汽冲洗冷凝管，数分钟后关闭夹子3，使反应管中的废液倒吸流到反应室外层，打开夹子7由橡皮管排出，如此数次。用蒸汽洗涤反应室约10min后，在冷凝管末端小玻璃管的位置放上一个盛硼酸-指示剂混合液的锥形瓶，将瓶倾斜，以保证冷凝管末端连接的小玻璃管完全浸于液体内。继续蒸馏1~2min。观察锥形瓶内溶液是否变色，如不变色，则证　　明反应室内部已洗涤干净；如果混合液变绿，说明定氮仪内有残留氨，没有洗涤干净，需要进一步用蒸汽洗涤。　　3.标准(NH4)2SO4滴定练习　　空白的滴定　　仪器洗涤好后，取一100ml锥形瓶，加入5ml硼酸溶液，并使冷凝管下端玻璃管插入硼酸溶液中。取下4棒状玻璃塞，利用2ml移液管准确向反应室加入2ml蒸馏水，然后将玻璃塞放回，再加入10ml30%NaOH溶液，加入少许蒸馏水，冲洗30%NaOH溶液，然后将玻璃塞放回，并留少量液体作水封。如果锥形瓶内的硼酸溶液由紫红色变为鲜绿色，从变色开始计时蒸馏3min,然后移动锥形瓶使液面离开冷凝管口约1cm，继续蒸馏1min，并用少量蒸馏水洗涤冷凝口外围，移去锥形瓶，立即用标准盐酸溶液进行滴定，当硼酸溶液变为浅粉红色时，停止滴定，记下消耗的Hcl体积。如果硼酸不变色，不需要进行滴定，空白管消耗Hcl体积记为0。　　标准(NH4)2SO4滴定　　用蒸馏水洗涤仪器2~3次之后，另