绿色荧光蛋白基因在苏云金芽胞杆菌中的表达与应用-微生物学专业毕业论文.docxVIP

摘要本文围绕绿色荧光蛋白基因在苏云金芽胞杆菌中的表达及应用，从以下几个 摘要 本文围绕绿色荧光蛋白基因在苏云金芽胞杆菌中的表达及应用，从以下几个 方面进行了研究，耿得结果如下： 1绿色荧光蛋白基因咖在苏云金芽胞杆菌中表达的初探 将携带蜡状芽胞杆菌特异启动子的g／：pmut3a基因克隆到穿梭载体口HT304 后，电转化至苏云金芽胞杆菌BMBl71，CryB，IPS78．11，4Q7，HD．80．21中。通过 荧光显微镜和Bio-assay Reader对含重组质粒pGFP一304的5个受体菌分别进行 荧光检测及定量分析。结果表明，g／pmut3a基因仅在苏云金芽胞杆菌无晶体突变 株BMBl71，CryB，IPS78—1l，4Q7中表达并可检测得到菌体发光，并建立了一套 适合于苏云金芽胞杆菌的咖标记与检测方法。 2．利用绿色荧光蛋白基因gyp研究芽胞杆菌的启动子活性 绿色荧光蛋白基因g和分别标记苏云金芽胞杆菌的cry3A启动予P。rv3A， Btl-Btll启动子P Bfj_BlIJ和来自蜡状芽胞杆菌特异启动子P44加以研究其表达差异。 其中，P。rv3A和PB。1．Btll分别与s,9构成融合基因，以调控g加在苏云金芽胞杆菌中 的表达。将重组质粒pGFP-304(含P44m)、pGFPExpA(含P。Y3A—efp融合基因) 和pGFPExpB(含PBtI-B【11．gtp融合基因)分别导入大肠杆菌和苏云金芽胞杆菌后 发现，P44-】2和P B【l-BtII在大肠杆菌与苏云金芽胞杆菌中均可表达g章，其中PBII_Btll 在大肠杆菌中具有极强的启动基因表达的能力。而P。ry3A不能启动翻p在大肠杆 菌中表达，在苏云金芽胞杆菌中启动的旦加表达的荧光强度也较弱。 3．携带不同启动子苏云金芽胞杆菌标记重组菌株的微量热学变化 生物活性检测器对含重组质粒pGFP一304，pGFPExpA和pGFPExpB的转化 子分别进行荧光检测及微量热检测。结果表明，3种启动子驱动下的蜀彩基因均 可在苏云金芽胞杆菌无晶体突变株BMBl71中表达并检测得到不同的发光类型。 微量热法检测发现P44．12和PBtI-BIII启动grp表达的代谢热低于Pcry3A驱动g和表达 的代谢热。 4．苏云金芽胞杆菌标记重组菌株的构建 本研究利用SOE法将构建的绿色荧光蛋白基因g勿和苏云金芽胞杆菌的杀 虫晶体蛋白基因crylAclO的嵌合基因克隆到穿梭载体pAD4412上获得成重组质 粒pBMBZGCl0。同时又将苏云金芽胞杆菌启动子PB帅i eii替换蜡状芽胞杆菌启动 子P44㈤经同一穿梭载体pAD4412构建得到了pBMBZGCll。再通过电转化法 将它们导入苏云金芽胞杆菌无质粒突变株BMBl71和CryB中获得重组菌株BMBl71(pBMBZGCl0)；CryB(pBMBZGCl0)；BMBl71(pBMBZGCl 将它们导入苏云金芽胞杆菌无质粒突变株BMBl71和CryB中获得重组菌株 BMBl71(pBMBZGCl0)；CryB(pBMBZGCl0)；BMBl71(pBMBZGCl n和CryB (pBMBZGCll)。经荧光显微镜观察标记重组菌株仅能在标记重组菌株 BMBl71(pBMBZGCl0)和CryB(pBMBZGCl0)中检测到嵌合基因的表达； SDS结果也显示了融合蛋白约为150 kDa大小的蛋白带型。 5．苏云金芽胞杆菌标记重组菌株的荧光检测分析 本研究分别利用Leica Stereo M2FIII型荧光显微镜、Leica Diaplan型荧光显 微镜和Zeiss Axioplan型激光共聚焦扫描显微镜，对苏云金芽胞杼菌标记重组菌 株的菌落、菌液、菌体分别进行荧光检测。Zeiss荧光显微镜激发光波长为488nm、 发射光波长为522nm(DF32)。并用Laser Sharp 2000 专用软件对收集到的图形 信号进行捕获和处理。近一步用Bio．assay Reader对标记重组菌株进行荧光强度 的检测，选择激发滤光片为485nm、发射滤光片为520nm。用HT Soft 2,0软件 分析所得数据。 6．帮助蛋白P20对苏云金芽胞杆菌标记重组菌株影响的研究 将携带有朋0基因的穿梭载体pBMB20．2，利用电转化的方法分别导入苏云 金芽胞杆菌标记重组菌株BMBl71(pBMBZGClO)和CryB(pBMBZGClO)得到 BMBl71fpBMBZGCl0．20)年n CryB(pBMBZGCl0．20)。经普通光学显微镜和荧光 显微镜观察P20基因对融合基因表达的影响。结果发现重组菌株BMBl71 (pBMBZGCl0-20)年n CryB(pBMBZGCl0．20)f毙够检测到很强的绿色荧光。进一步 通过荧光强度分析表明，20kD