绵羊精原干细胞标记分子CDH1多克隆抗体的制备及应用-动物学专业毕业论文.docxVIP

1 1 CDHl抗体效价的初步测定 。14 2间接ELISA测定CDHl多克隆抗体的效价 ．14 3蛋白质浓度测定 ．15 4 Western免疫印迹(Western blotting) 16 5免疫荧光检测绵羊睾丸冰冻切片中CDHI蛋白的表达 16 讨论 ．．17 参考文献 l 8 第二章应用CDHl多克隆抗体鉴定体外培养的绵羊精原干细胞 20 引言 。20 材料和方法 ．21 1材料 21 2研究方法 ．22 结果 ．．25 1共培养细胞免疫荧光检测 ．．25 2纯化培养的绵羊精原干细胞的免疫荧光染色 ．26 讨论 ．．27 参考文献 。27 文献综述精原干细胞标记分子的研究进展 30 一引言 。30 二精原干细胞的标记分子 ．．32 三精原干细胞的分子表型 ．38 四研究精原干细胞标记分子的方法 ．40 五研究精原干细胞标记分子的意义 41 六讨论 43 参考文献 44 I 内蒙古大学 内蒙古大学 硕士学位论文 致谢 。5 1 攻读学位期间发表的学术论文 ．53 胡甜园 胡甜园 绵羊精原干细胞标记分子CDHl多克隆抗体的制备及应用 绵羊精原干细胞标记分子CDHl多克隆抗体的制备及应用 摘要 CDHl(cadherin 1，又称E．cadherin)是一种钙离子依赖型跨膜粘着分子，这 种糖蛋白对胚胎发育非常重要，并参与调节生殖细胞的分化，CDHl的主要作用 是在钙离子的存在下介导细胞间粘着。这种粘着是通过CDHl胞外区域与相同 分子同型作用或与不同钙粘蛋白异型作用来实现的。有研究发现CDHl这种细 胞间粘着分子在小鼠睾丸未分化A型精原细胞中特异表达，这个标记分子可以 使我们研究曲细精管中未分化A型精原细胞的形态和分布。在睾丸中，生殖细 胞的密度是由精原干细胞的数量和‰删(～)细胞簇的大小来决定的，这种精 原干细胞和生殖细胞数量之间的平衡可能是由CDHl分子介导的细胞粘着来实 现的，因此CDHl在雄性生殖系统中具有重要的作用。 本实验用亲和层析获得的绵羊CDHl抗原表位多肽作为抗原免疫BALB／c 小鼠，并在免疫后对小鼠注射S180细胞刺激其产生腹水以获得多克隆抗体。获 得抗体后，用纯化的抗原表位多肽经间接酶联免疫吸附实验(ELISA)检测抗体的 效价，并进行免疫印迹分析实验(western blotting)检测所制备多克隆抗体的特异 性，实验结果证明制各的多克隆抗体效价较高，具有高特异性和敏感性，可用 于研究曲细精管中未分化A型精原细胞的形态和分布。同时还应用制备好的 CDHl多克隆抗体对绵羊睾丸组织冰冻切片、绵羊体外共培养体系中的生殖细胞 1 内蒙古大学 硕士学位论文 和纯化培养的绵羊精原干细胞进行免疫荧光染色，结果显示，本实验制备的 CDHl 抗体可以用于对精原干细胞的鉴定，并对其形态和分布的研究具有重要意 义。 关键词:绵羊，精原干细胞， CDHl ，多克隆抗体，免疫荧光染色 2 glycoprotein，which glycoprotein，which is essential for embryonic development and involved in regulating germ cell determination．CDH 1 facilitates cellular adhesion in the presense of calcium as the extracellular domain undergoes homotypic／heterotypic interactions with other cadherins．CDH 1，a homophilic cell-cell adhesion molecule spanning the cell membrane，is expressed specifically in undifferentiated type A spermatogonia in mouse testes．This new cell surface marker enabled US to identify the morphology and topographic arrangement of undifferentiated type A spermatogonia in seminiferous tubules．Both the number of spermatogonial stem cells and colony size of A,a clusters in the monse testis are important factors regulating the germ cell density in seminifer