棉花显微切割技术体系的建立及着丝粒序列探索研究-作物遗传育种专业毕业论文.docxVIP

华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书学位论文 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 琢 如需保密，解密时间 年 月 日 是否保密 譬 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果．尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料，指导教师对此进行了审定．与我一阍工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中做了萎月确的说明，并表示了谢意． 研究生签名：柱膨钞 时阔： ≯，厂年夕月夕1日‘ 学位论文作者签名：古瘤易巳导师』i◆ 注：请将本表赢接装订在学位论文的扉页和目录之间 棉花显微切割技术体系的建立及着丝粒序列探索研究目 棉花显微切割技术体系的建立及着丝粒序列探索研究 目 录 摘 要 ．I Abstract ．．III 缩略语表 V 第一章文献综述 一1 1．1染色体分离技术及其应用研究 l 1．1．1染色体显微切割的技术原理 ．1 1．1．2染色体显微切割、微克隆技术操作规程 2 1．1．3染色体微切割、微克隆技术在植物中的应用 ．5 2．1植物着丝粒研究进展 6 2．1．1植物着丝粒DNA组成 一6 2．1．2植物着丝粒蛋白 ．．8 2．1．3植物着丝粒的进化机制 ．9 2．1．4着丝粒区序列的分离与克隆方法 11 3．1荧光原位杂交技术(FISH)及其在植物中的应用 12 3。1．1荧光原位杂交技术的发展 一 ．12 3．1．2荧光原位杂交技术在植物研究中的应用 13 1．4本研究的目的与意义 ．15 第二章材料与方法 ．．16 2．1实验材料 ‰ ．．1 6 2．1．1棉花材料 ．．16 2．1．2酶和生化试剂 16 2．1．3切割仪器耗材 16 2．2实验方法 ．1 6 2．2．1有丝分裂中期染色体玻璃载片的制备 ．16 2．2．2有丝分裂中期染色体膜载片的制备 一17 2．2．3单染色体／片段的显微分离及LA．PCR扩增 18 2．2．4 PCR扩增 ．20 2．2．5克隆及质粒DNA的提取 23 华中农业大学201 华中农业大学201 l届硕士研究生学位论文 2．2．6荧光原位杂交验证 24 第三章 结果与分析 27 3．1显微切割及结果验证 ．．27 3．1．1中期染色体玻璃制片 27 3．1．2显微切割体系的建立 27 3．2 PCR扩增及产物的验证 。32 3．2．1设计引物的PCR扩增 32 3．2．2 PCR产物的FISH验证 ．．32 3．2．3 K202产物的克隆及重组子的鉴定 34 3．2．4各片段的进一步检测 35 3．2．5 800 bp左右的片段阳性克隆序列分析 ．36 第四章讨论 o 38 4．1中期染色体的膜制片 。38 4．2单染色体或片段的显微分离 38 4．3扩增产物的获得及验证 ．．39 4．4 K202引物扩增 ．40 参考文献 42 致 谢 ．．53 Ⅱ 棉花显微切割技术体系的建立及着丝粒序列探索研究摘要 棉花显微切割技术体系的建立及着丝粒序列探索研究 摘要 着丝粒结构和功能、物理图谱着丝粒区Gap填补等已成为当今分子细胞生物学 与分子细胞遗传学的热点之一，而对于棉花的着丝粒的研究，至今尚未取得突破性 进展。棉花是我国乃至世界最重要的纤维经济作物之一，对棉花着丝粒的研究，不 仅有利于进一步阐明各棉种之间的遗传进化和亲缘关系，而且也会为正在进行的棉 花基因组测序的序列拼接提供借鉴和帮助。本研究利用显微切割技术及PCR扩增技 术，探寻棉花的着丝粒序列，主要研究结果如下： 1．棉花染色体或染色体片段微分离及LA．PCR技术体系的建立。采用前低渗、酶解、 后低渗和压片相结合的方法获得适于切割的中期染色体膜制片，进而形成一套行之 有效的单染色体或染色体片段的切割流程。对切割获得的目标染色体或片段，利用 LA．PCR进行扩增，这样可以大大减少对目标染色体或片段的收集。扩增后，通过 FSIH验证，形成了完整的验证体系。建立了一套高效、快捷、易于操作的棉花染色 体片段微分离技术体系。 华中农业大学201 华中农业大学201 1届硕士研究生学位论文 验证结果显示，只有K202引物扩增的产物在亚洲棉染色体上产生信号，信号位于 端粒附近。对K202扩增的序列进行分别验证，发现端粒附近的信号由818bp的片 段所产生。对818bp的序列进行测序，序列比对发现，它与gypsp类的逆转录转座 子有94％1拥源性，与陆地棉LIB5327．017．A1-N1．D12 P S Gb557中的微卫星序列 相比，同源性高达98％。 关键词：显微切割、接头PCR扩增、荧光原位杂交、着丝粒 Ⅱ AbstractOver Abst