锰对原代培养肉鸡肝细胞脂肪合成关键酶活性及其基因表达的影响-动物营养与饲料科学专业毕业论文.docxVIP

独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经 发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业科学院或其它教育机构的学位 或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文 中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名： L 蔓 次． 时间：Zoll年 厂月伽Et 关于论文使用授权的声明 本人完全了解中国农业科学院有关保留、使用学位论文的规定，即：中国农业 科学院有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影 印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业科学院可以用不同 方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 (保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 论文作者签名：殳 炎落时间： 劢JJ年 ‘月伽日 导师签名： 曩州 时间：杪lf年∥月,v,tTEt I 摘要本论文通过3个试验，研究了不同锰水平和不同形态锰源对体外原代培养肉鸡肝脏细胞脂 摘要 本论文通过3个试验，研究了不同锰水平和不同形态锰源对体外原代培养肉鸡肝脏细胞脂 肪合成关键酶【脂肪酸合成酶(Fatty Acid Synthase，FAS)、苹果酸脱氢酶(Malic Dehydrogenase，MDH)】活性及其基冈表达的影响，从细胞及分子水平探讨了锰对肉鸡脂肪合 成影响的可能作用机制。 试验一旨在建立稳定、可靠的肉鸡肝细胞体外原代培养技术体系，为下一步研究锰对肉鸡 肝细胞脂肪合成关键酶的影响奠定方法学基础。本试验以健康的21～24日龄的从肉公鸡为试 验动物，采用改良的原位两步灌注法分离肝脏细胞，以Leibovitz’S L．15培养液为基础培养液进 行体外培养。结果表明：采用改良的原位两步灌注法分离的肉鸡肝脏细胞，分散程度高，纯度 好，经血细胞计数板计数，一只2l～24日龄的肉仔公鸡的肝脏可以获得(2_-I：1)×109个细胞，台 盼蓝拒染法测得细胞活率均在95％以上；以Leibovitz’S L．15培养液为基础培养液对肝细胞进行 单层原代培养，培养7天肝细胞仍能维持正常的细胞形态，可满足后续试验的需要。 试验二研究不同锰(源于无机氯化锰)水平对21--24日龄的肉公鸡原代培养肝细胞中脂肪 合成关键酶活性及其基因表达的影响。本试验所用肉仔鸡从1日龄至手术前均饲喂除锰外所用 营养成分均满足NRC(1994)建议的l～3周肉仔鸡营养需要量的玉米．豆粕型基础饲粮(含锰为 19．69mg／kg)，使试鸡处于临界缺锰状态。本研究共包括两个试验。试验1根据添加不同锰水平 对肉仔鸡肝细胞乳酸脱氢酶(1actic dehydrogenase，LDH)漏出的影响，米确定培养液添加锰浓 度的非毒性范围及适宜锰添加水平。试验2根据试验l的结果，在培养液中添加不同水平的锰 培养肝细胞一定的时间，研究不同锰水平对原代培养的肉仔鸡肝细胞中脂肪酸合成酶活性和基 因表达的影响。试验l采用单冈子完全随机试验设计，在培养液中分别添加0 mM、0．02 mM、 0．2 mM、0．5 mM和l mM锰，共5个处理组，分别培养24h和48h，每个处理6个重复，每只 鸡分离得到的肝细胞为一个重复。结果表明：肉仔鸡肝细胞经不同锰水平培养液分别培养24h 和48h后，均显著降低了肝细胞LDH的漏出(p0．0001)，肝细胞培养液中LDH的活性随锰 添加水平的增加早明显的二次曲线降低，锰的适宜添加水平为0．56-0．57 mM，锰添加水平为 lmM时没有对肝细胞产生毒性。试验2采用单因子完全随机试验设计，在培养液中分别添加0 mM、0．25 mM、0．5 mM和0．75 mM锰，共4个处理组，分别培养24h和48h，每个处理6个重 复，每只鸡分离得到的肝细胞为一个重复。结果表明：不同锰添加水平培养液培养24h对肝细 胞中FAS和MDH活性及其mRNA水平均无显著影响(pO．24)，但添加锰有降低MDH mRNA水平的趋势。不同锰添加水平培养液培养48h，显著降低了肝细胞中FAS和MDH mRNA水平(pO．001)，且随着锰添加水平的增加，FAS和MDH mRNA水平有下降趋势；添 加锰对FAS和MDH的活性无显著影响(po．17)，但添加锰有降低FAS和MDH活性的趋 势。 试验三研究不同水平及形态锰源对21,--24日龄肉公鸡原代培养肝细胞LDH的漏出、肝细 胞中脂肪合成关键酶(FAS和MDH)活性及其基冈表达的影响。试鸡饲粮同试验二。试验采用 2x2两因子完全随机设计，两种锰源分别为中等络合强度氨基酸锰(MnAA)和无机氯化锰，两 个锰添加水平分