棉花悬浮细胞系的建立及其培养细胞的程序性死亡的观察分析-作物遗传育种专业毕业论文.docxVIP

摘 摘 要 细胞的死亡一般分为程序性死亡和坏死两种。细胞程序性死亡(programmed cell death，PCD)是指生物在发育和胁迫反应中的一种受基因控制的、主动的、有序的细 胞死亡过程。对动物细胞程序性死亡的研究表明，PCD一般具有比较典型的形态和 生化特征，即细胞收缩、核浓缩、染色质边缘化、核DNA被剪切成寡聚核小体大 小的片断并最终被膜包围形成凋亡小体。核DNA降解断裂产生带有3--OH端的寡 聚核小体片断，在凝胶电泳上呈以140．180bp倍增的DNA“梯”(DNAladder)。坏 死(necrosis)是一种不受细胞控制的损伤性细胞死亡过程，坏死细胞不能呈现出DNA ladder。根据DNAladder的有无，可以将PCD与细胞坏死区分开来。对整株植物进 行PCD机理的研究常常要涉及到要将死亡细胞从正常细胞区分开来，而每个单个细 胞细胞都有其内在的死亡表达程序。因此，建立由单细胞或原生质体组成的悬浮系 可以大大的降低细胞环境的复杂性，可作为PCD研究的理想系统，对研究PCD的基 因表达调控机理和信号传导途径非常有利。近年来，对植物细胞程序性死亡的研究 报道不断增多，其中很多工作都是从悬浮细胞系着手的。 本试验选用陆地棉(Gossypium hirsutum．LJ品种“珂字201”和“鄂抗9”作为试 验材料，从无菌苗下胚轴切段诱导愈伤组织，建立棉花悬浮细胞系：同时对棉花悬 浮细胞系建立过程中激素的配比和浓度、培养基成分、悬浮细胞的生长过程进行了 较系统的研究。结果表明：MS+2，4-D 0．5 mg／L+KT 0．1 mg／L和MS+2，4-D 0．1 mg／L +KT 0．1 mg／L培养基有利于细胞分裂，能产生体积较大，均匀一致，细胞活力强的 单细胞和小细胞团，适合于进行细胞生长调控及PCD研究。而MS+IBA 0．5 mg／L+KT 0．1 mg／L和MS+IBA 0．1 mg／L+KT 0．1 mg／L培养基则有利于形成大的细胞团和不同时期 的胚状体，适合于进行胚状体的发生发育的研究。钾盐、肌醇有利于细胞的分裂增 殖，且能抑制胚状体的发生。可以通过增加钾盐(K+)、肌醇含量来调节细胞的生长 状态和细胞活性，以建成分裂增殖快、细胞活性强的悬浮细胞系。在悬浮培养过程 中，管状细胞渐渐消失，被球状的单细胞和小细胞团所替代。棉花胚性愈伤悬浮细 胞的生长曲线呈S形，在起始培养的O～3d，是生长的延迟期：在第3～15d，是指数 增长期；到第15d以后，生长速度降低，是静止期。悬浮培养的棉花细胞必须在15d 以前进行继代，以保持其旺盛的分裂能力和细胞活性。 试验中以棉花悬浮细胞系为研究对象，探讨了在自然衰老和在热激、喜树碱、 串珠镰孢菌毒素、放线菌酮等诱导条件下细胞程序性死亡的发生机制。通过细胞学 串珠镰孢菌毒素、放线菌酮等诱导条件下细胞程序性死亡的发生机制。通过细胞学 观察和抽提基因组DNA进行琼脂糖胶电泳研究表明，棉花胚性悬浮细胞在MS+2，4-0 0．1 mg／L+KT 0．1 mg／L培养基中培养至第17天，细胞生活力开始下降；至第21天 可检测到核小体大小倍增的DNA Ladder存在。42±3。C热激、lOlamol／L喜树碱、 20啪ol／L串珠镰孢菌毒素和50mmol／L放线菌酮分别处理可诱导MS+2，4-D 0．1 mg／L+KT 0．1 mg／L培养基中的棉花悬浮细胞发生程序性死亡。在MS+2，4-D 0．1 mg／L+KT 0．1 mg／L和MS+IBA 0．1 mg／L+KT 0．1 mg／L培养基中悬浮培养的棉花胚性 细胞处于不同的生理状态，两种不同状态的棉花悬浮细胞对热激、喜树碱、串珠镰 孢菌毒素等诱导因子的反应不同。 试验中还发现，棉花胚性悬浮细胞在仅含生长索的Ms培养基上培养时，生长良 好：但当转入到不含生长素的Ms培养基培养时，在1—7天内则会大规模的死亡。对 这些细胞进行染色(FDA、DAPI)和细胞学观察发现，在转培养后第3—4天可见明显 的核质浓缩、胞质收缩，而高温处理引起的细胞坏死无此现象。抽提悬浮细胞基因 组DNA进行凝胶电泳又发现：这种细胞死亡还伴随有典型的DNA Ladder出现，而细胞 坏死和对照无DNA Ladder。表明这种由生长素撤除引起的细胞死亡是一种程序性死 亡。且这种细胞死亡能被水解酶抑制剂(NEM、TLCK)和Caspase抑$蜊(AC-YVAD—C}fIK) 所抑制，从而进一步证明这种细胞死亡是一种PCD，同时也表明水解酶和类Caspase (CLPs)参与到了这类细胞程序性死亡(PCD)过程之中。 研究中还发现，棉花悬浮细胞经高浓度细胞分裂素(2 mg／L KT或4 mg／L KT) 处理后也