抗日本血吸虫感染表位PDDV疫苗的研究-病原生物学专业毕业论文.docx

南京医科大学博士学位论文抗日本血吸虫感染表位PDDV的研究 南京医科大学博士学位论文 抗日本血吸虫感染表位PDDV的研究 博士研究生： 张蕾 导 师： 张兆松教授 中文摘要 血吸虫病(schistosomiasis)是全球第二大严重危害人类健康 的寄生虫病，我国有现症患者80余万，受威胁人口达1亿。虽然经 过半个多世纪的控制努力，血吸虫病的人群感染和流行已大大降低， 但是作为一种严重的人兽共患病，仍有许多问题尚未解决． 控制血吸虫病的传播和流行需采取以吡喹酮反复群体化疗，辅 以灭螺等的综合防治手段。但随着血吸虫的感染和反复再感染，以 及吡喹酮耐药性的出现，血吸虫病疫苗的发展提到日程上来。有效 的抗血吸虫疫苗不仅能长期控制血吸虫病，甚至可能消灭它。而阐 明血吸虫病免疫保护的机制是研制血吸虫病疫苗的前提条件。目前， 有关抗血吸虫保护力的相关免疫学机制仍不明确。 本研究拟从诱导宿主保护性免疫应答为出发点，用生物信息学 工具从不同疫苗候选分子中筛选T／B细胞表位，以粒细胞．巨噬细胞 集落刺激因子(GM-CSF)为佐剂，利用阳离子肽技术制备表位肽． 核酸双疫苗(PDDV)，并观察单个及混合表位PDDV在小鼠体内 诱导的免疫应答，及其对小鼠抗日本血吸虫感染、抗病理的作用， 为探索日本血吸虫病疫苗研制的新途径和探讨日本血吸虫感染的保 护性免疫机制提供有益的实验研究资料．为此，本文进行了以下几 南京医科大学博士学位论文个方面的研究。 南京医科大学博士学位论文 个方面的研究。 一、生物信息学分析、预测日本血吸虫抗原分子表位 为了优化疫苗的设计，分析预测日本血吸虫病疫苗候选抗原分 子中的T／B细胞表位，应用多种在线数据库和软件分析10个日本 血吸虫潜在疫苗候选抗原分子(Sj 14，s397，Sj 14—3—3，Sj22．6，Sj23， Sj26，Sj28，Sj338，Sj62，sjzPi)，预测人类基因型HLA．DRBl‘0401、 HLA-A*0201以及C57BL／6小鼠基因型H-2b(H-2Kb、H．2Db)的 对应细胞表位，包括MHC I类分子相关的CTL表位，MHCII类分 子相关的111表位和抗体相关的B细胞表位。并进行蛋白酶体水解 位点预测，以剔除表位递呈至体内可能被水解的片段。再用BLAST 比对与研究对象(～小鼠)相应蛋白分子的同源性，剔除同源性高 的表位以避免自身免癌反应。最终根据10个抗原分子的T／B细胞 表位的表位分析结果，表位蛋白酶体水解位点预测以及同源性比对 的结果，综合后得到小鼠基因型的日本血吸虫抗原分子CTL，Th 和B细胞表位各3个，用于后续研究。 二、抗日本血吸虫感染表位PDDV疫苗的构建 为了更好的提高抗日本血吸虫感染疫苗的效果，采取了PDDV 的形式。根据研究一中预测所得的9个表位序列，在每个表位的N 端加上18个赖氨酸的阳离子肽作为连接桥，合成相应的肽段，并合 成带有酶切住点的互补的表位相应DNA正负链。将互补DNA正负 链退火后的片段插入双酶切过的载体PUMVCl-mGM-CSF，构建含 抗原袁位肽编码基因的重组真核表达载体，并通过双酶切实验和 南京医科大学博士学位论文DNA测序鉴定。测序结果显示构建的载体中含有相应表位肽编码基 南京医科大学博士学位论文 DNA测序鉴定。测序结果显示构建的载体中含有相应表位肽编码基 因序列．同时构建不同组合的CTL、Th和B表位肽编码基因串联 的表达载体。再将含抗原表位肽DNA的质粒与相应肽段通过正负 电荷作用连接成纳米大小的颗粒，构建成Peptide．DNADual Vaccine (PDDV)．并对不同制备条件下的PDDV通过电泳阻滞试验、DNase I保护性试验和电镜观察对其理化特性进行鉴定，选取最优化的条 件(NaCl的浓度为150mmol／L，肽与质粒DNA比值为4)制备表 位PDDV．在这个优化的条件下制备出的PDDV可以保护DNA不 被核酸酶降解，电镜下观察颗粒大小均匀，直径约15nm左右，符 合抗原递呈的要求。最终制备的含有不同表位的PDDV，用于小鼠 模型的进一步研究。 三，表位PDDV在小鼠模型上的免疫学特性及免疫保护性的实 验研究 为研究表位PDDV在小鼠模型上的免疫学特性，以及在抗日本 血吸虫感染乖抗病理方面的作用。将小鼠分为29组，制备好的单表 位PDDV或CTL、Th、B混合表位PDDV按照每只小鼠每次IoorI_I 进行免疫，注射PBS作为对照，每2周免疫一次，共3次，末次免 疫后l周剖杀6只小鼠／生g，取淋巴结乖脾脏细胞进行51Cr释放试验 检测细胞杀伤力、3H掺入法检测细胞增殖以及ELISA检测细胞因 子口N-Y和m-4的检测；取血清进行ELISA检测抗体IgG及其亚 类毽G1和IgG2a水平。在CTL表位PDDV小鼠组可