慢病毒介导shRNA稳定持续抑制口蹄疫病毒增殖的两类细胞系的建立-预防兽医学专业毕业论文.docxVIP

中圆农娩科学院 中圆农娩科学院 摘 摘 要 RNA干扰(RNAi)是广泛存在于生物界的一种由内源性或外源性双链RNA分子诱发的同源 mRNA高效特异性降解的现象，是许多生物具有的对抗入侵的核酸，保护自身的天然机制。诱发 RNAi的最关键分子是长度为19-27bp的双链RNA，被称为小干扰RNA(small interfering RNA。 siRNA)。随着RNAi机制及其应用研究的不断深入，人们发现无论体内还是体外试验，siRNA均 能够抑制多种病毒的增殖。近年来，许多学者以人工诱导RNAi的方式进行了病毒复制的干扰研 究，取得了良好进展，因此RNAi技术被认为是最有应用价值的抗病毒感染方法之一。 口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的多种偶蹄动物共患的急性传染病，被国际兽疫局列为A类传染 病之首。由于口蹄疫病毒非常容易发生变异，导致新的变异株不断出现、更迭，传统的疫苗免疫 等措施不能有效地应对口蹄疫的爆发和流行。RNAi现象的发现及其在抗病毒方面的研究进展， ’为FMD的防制研究开辟了一个新的探索领域。本研究针对口蹄疫病毒的体外复制进行了RNA干 扰的成功探索。FMDV的2B和如l基因在FMDV不同血清型和亚型中非常保守，根据美国 lnvitrogen公司提供的siRNA在线设计结果，针对凹和3D区段设计并合成了5个shRNA模板， 同时设计了一个无关对照shRNA模板，分别克隆到shRNA表达载体的U6启动子下游，构建了 6个相应的shRNA表达质粒。 首先，从细胞水平研究了sb_RNA表达载体对31)基因表达的抑制作用，将如I基因克隆到真 核表达载体pEGFl-m中，获得重组的融合表达质粒pEGFP+3D。将针对3D基因的4个干扰质 粒分别与pEGFP+3D共转染PK-15细胞，经荧光显微镜观察、流式细胞仪和real-time RT-PCR分 析，表明pENFU6-3D1、pEN／U6-3D2、pEN／U6-3D3和pEN／U6．3D4对319基因的表达有一定的抑 制作用，其中pEN／U6-3D2和pEN／U6-3D4的效果较为突出。 然后将pEN／U6．3D2，pEN／U6．3D4，pEN／U6．2B和pEN／U6．CON进行LR重组生成对应的 pEX／U6-3D2，pEX／U6-3D4，pEX／U6-2B和pEX／U6-CON。接着将重组后的表达载体在转染试剂介 导下和辅助质粒一同转染293FT细胞，在转染后50h时收获慢病毒。将上述慢病毒转染原代羊胚 胎成纤维细胞和PK-15细胞，48h时换成带有抗性的培养液进行筛选，14天左右的时间获得单克 隆细胞株，扩大培养后保存各细胞株，其中FMDV特异性shRNA稳定表达细胞株6株，阴性对 照shRNA稳定表达细胞株2株，提取上述细胞株的基因组经PCR鉴定确实为shRNA转基因阳 性克隆。最后利用观察CPE、TCID50测定、间接免疫荧光试验和real-time PCR等方法检验了上 述细胞株对FMDV增殖的抑制效果。结果显示，阴性对照克隆和未转基因的空白对照在接种病 毒24h后，两株细胞克隆的感染率均比稳定整合FMDV特异性干扰序列的阳性细胞克隆的感染 率高，并且二者差别显著。 一●，，』 关键词：RNAi，口蹄疫病毒，抑制，shRNA，慢病毒 AbstractRNA Abstract RNA interference(RNAi)iS a natural process of eukaryotic cells through which endogenous or exogenous double-stranded RNA(dsRNA)directs the specific degradation of homologous mRNA．硼惦 phenomenon were discovered in almost all organisms．Its mechanism seems to be a cellular defense mechanism against gene invaders such as viruses and transposons．The key f缸tor to initiate RNAi process is the double-stranded small interfering RNAs(siRNAs)with a length of 19-27bp．With the progression of the research on RNAi，people have found that siRNA could be able to inhibit the replication of many viruses加vivo or／n vitro．In