氯化汞对大鼠原代睾丸间质细胞类固醇激素合成的影响-卫生毒理学专业毕业论文.docxVIP

幽IIIIIIllll 幽IIIIIIllll lllIII III III IIIII Y1 833082 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研 究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人 或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人雨l集 体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任南本人承担。 一：高．慧．轴嗍年月日 学位论文使用授权声明 本人在导师指导下完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属郑州大学。 根据郑州大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部 门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论义被查阅和借阅；本人授权郑州 大学町以将本学位论文的全部或部分编入有关数据库进行检索，可以采用影印、 缩印或者其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。本人离校后发表、使用学 位论文或与该学位论文直接相关的学术论文或成果时，第一署名单位仍然为郑 州大学。保密论文在解密后廊遵守此规定。 学位论文黼高。萼．轴吼 年月日 摘要摘要 摘要 摘要 危害生殖健康的环境污染物种类较多，重金属是其中之一。汞可以对神经 系统、血液系统、消化系统及生殖系统等造成损伤。汞可以在睾丸组织蓄积而 影响精子的质量、数量及精子的产牛，诱发男性彳育症。 目的 该研究利用成年大鼠睾丸问质细胞(Leydig cell)作为模型，通过观察氯化 汞对睾丸间质细胞类同醇激素合成的影响，以进一步探讨无机汞对雄性生殖系 统的毒作用机制。 、方法 1．睾丸间质细胞的提取、纯化及攀定 2．Leydig细胞贴壁时间的选择：睾丸间质细胞分别培养2 h、3 h、6 h、12 h、 24 h后，收集尚未贴壁的：悬浮细胞和培养液转移到新的培养瓶内，加含血清的 DMEM／F12培养液继续培养；原培养瓶内的细胞改加无血清培养液继续培养。 显微镜下分别观察细胞数目和形态，确定最佳贴壁时问。 3．HgCl2对Leydig细胞活性的影响：分别加入含不同浓度HgCl2培养液染毒 细胞，采用MTT法，确定染毒剂量。 4．Lcydig细胞培养上清中孕酮含量的测定：睾丸问质细胞做如下操作：①加 入人绒毛膜促性腺激素(HCG)终浓度分别为O．0lU／ml、0．1IU／ml、1．0lU／ml、 10．0IU／ml和100．0IU／ml培养液培养4 h后，提取培养上清液，采用放射免疫分 析法(RIA)测定孕酮含量；@用10击mol／L HgCl2和10．0 IU／ml HCG混合染毒 细胞，加入10．0 IU／ml HCG的作为对照，分别在l h、2 h、3 h、6 h、12 h、24 h 提取培养上清液，RIA测定孕酮含量；④分别加入含101U／ml HCG的HgCl2浓 度为0 mol／L、10～molFL、10～molFL、10击mol／L和10’5mol／L的无血清培养基， 染毒3 h后，RIA测定上清中孕酮的含量。 5．Leydig细胞中StAR、P450scc和3D—HSD mRNA表达水平：分别加入HgCl2 终浓度为10一mol／L、10～mol／L、10击mol／L、105mol／L的无血清培养基，0mol／L 剂量组为对照组，染毒3 h后，提取RNA，运用实时定量PCR技术检测HgCl2 对Lcydig细胞中StAR、P450scc和3p．HSD mRNA表达的影响。 结果 摘要1．鉴定结果：Leydig细胞活率在90％以上，纯度约为97％，均达到试验 摘要 1．鉴定结果：Leydig细胞活率在90％以上，纯度约为97％，均达到试验 要求。 2．Leydig细胞贴壁时间的选择和确定：6 h，12 h和24 h组原培养瓶内的细 胞数量一致，12 h和24 h原培养瓶内细胞形态一致且较6 h组形态相对混杂， 所以确定6 h为最佳贴壁时间。 3．MTT结果：104mol／L HgCl2抑制细胞的活性(P0．05)；其他剂量组和 对照组相比差异无统计学意义(尸O．05)。 4．RIA结果：①在HCG刺激下，睾丸Leydig细胞分离孕酮的量HCG浓度 为10IU／mI时最高。因此，选择101U／ml作为HCG的刺激浓度；②染毒组和对 照组的Leydig细胞分泌孕酮的量均在6 h到达峰值，且在各时间点混合组的孕 酮量均低于对照组，但仅在3 h和12 h两个时问点，两组问的差异有统计学意 义(尸O．05)。因为在睾酮乍成的过程中，孕酮可以在细胞色素P450 17c【．羟化 酶(P450c17)作用下转变为其他类固醇激素，故选择染毒时间为3 h。o Leydig 细胞经不同浓度HgCl2染毒后，Leydig细胞分泌孕酮的量均有所降低，其中 10’‘7mol／L和10一mol／L